基于网络药理学及实验验证补骨脂乙素治疗2 型糖尿病的作用机制

刘晓然，李志齐，李雅娜，姜文国，夏振红

滨州医学院，山东 烟台 264003

2 型糖尿病是世界上发病率持续上升的流行病之一[1-2]，其特征是由胰腺β 细胞的进行性丢失或胰岛素抵抗和高胰岛素血症诱导的高血糖[3]，这与肥胖、氧化应激和炎症密切相关[4-6]。胰岛素抵抗主要发生在肌肉、脂肪和肝脏组织细胞中，胰岛素抵抗导致细胞摄取葡萄糖减少[7-8]；在肝细胞中，胰岛素抵抗导致糖异生和葡萄糖输出增加[9]。随着2 型糖尿病的加重，由于糖脂毒性β 细胞数量逐渐减少，产生胰岛素的能力逐渐降低[10]。2 型糖尿病可引起多种发症，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病和糖尿病心血管功能障碍等疾病[11]，因此糖尿病患者的需求不仅要控制血糖，还要预防和治疗由于长期高血糖引起的并发症。

目前临床上有许多治疗2 型糖尿病的药物，但这些药物在降血糖的同时，具有一些不良反应[12]。此外，糖尿病并发症的发展并未得到完全根治，因此开发新的、更有效和更安全的药物以治疗2 型糖尿病及其并发症的需求仍然存在，据报道天然化合物及其有效成分在2 型糖尿病的防治中不良反应少、疗效稳定、可长期使用，还通过多靶标、多途径调节代谢紊乱，改善葡萄糖稳态。因此，一些具有降血糖活性的中药越来越受到人们的关注。

补骨脂已被用于治疗多种疾病，包括癌症、炎症性疾病、神经退行性疾病等。补骨脂提取物通过抗凋亡和抗纤维化功能降低糖尿病的糖毒性，改善糖尿病肾病[13-14]。补骨脂乙素是一种从补骨脂种子中提取的黄酮类化合物，传统上用作膳食成分，类黄酮对糖尿病具有多重保护作用[15]，补骨脂乙素作为黄酮类的化合物，可能对2 型糖尿病产生有益影响。研究表明，补骨脂乙素具有抗菌、抗炎、抗癌、抗结核和抗氧化活性[16]；补骨脂乙素可以通过核因子-κB（NF-κB）通路抑制糖尿病大鼠肾炎，改善糖尿病大鼠的肾损伤[17]；补骨脂乙素还可以抑制脂肪细胞和斑马鱼体内的脂质积聚[18]，表明补骨脂乙素和2 型糖尿病和脂质代谢有一定的相关性，但补骨脂乙素治疗2 型糖尿病尚缺乏相关报道。

网络药理学利用公共数据库和文献作为样本，并使用网络可视化工具分析和发现潜在的药物和疾病靶点，以预测药物的潜在作用靶点和途径，揭示中药或其复杂成分的作用机制。本研究通过网络药理学数据分析以揭示补骨脂乙素在2 型糖尿病治疗中的潜在作用，探究补骨脂乙素在2 型糖尿病治疗中的作用机制，在细胞水平构建胰岛素抵抗细胞模型并进行实验验证，为补骨脂乙素在2 型糖尿病治疗中的应用提供一个新的研究视角和理论基础。

1 材料与方法

1.1 补骨脂乙素作用靶点的获取

采用 ECTM 数据库（http://tcmip.cn/ECTM/index.php），查找补骨脂的活性成分补骨脂乙素相应的候选靶基因。将PubChem 数据库（https://Pub Chem.ncbi.nim.nih.gov）提供标准的补骨脂乙素的Canonical SMILES 格式，导入为“Homo sapiens”预设的SwissTargetPrediction 数据库（http://www.SwissTargetPrediction.ch）中，预测补骨脂乙素潜在目标。整理补骨脂乙素作用靶点并删除重复靶点。

1.2 疾病靶点的获取

基于GeneCards 以“type 2 diabetes”为关键词获取与2型糖尿病相关的靶点，靶点根据“Relevance score”降序排列，通过 MEDIAN 函数，保留Relevance score＞5.795 82 的靶点，通过查阅文献补充靶点并删除重复的靶点。

1.3 补骨脂乙素抗2 型糖尿病作用靶点的预测

将上述得到的补骨脂乙素作用的相关靶点以及2 型糖尿病相关靶点导入Venn 数据库（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）中进行交互分析，获得交集靶点作为补骨脂乙素治疗2 型糖尿病的作用靶点。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析

将相互交集的靶点导入 STRING 数据库（http://sting-db.org），计算蛋白相互网络关系，物种选“Homo sapiens”，以节点（node）和“边”（edge）表示靶点关联程度。同时采用Cytoscape 3.9.1 软件对所得结果进行拓扑分析，通过插件MCODE 进行基因簇的分析，结合插件Cytohubba 的MCC 算法筛选核心靶标。

1.5 富集分析

将关键靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov）做聚类分析，并对关键靶点所涉及的细胞功能（CC）、分子功能（MF）、生物功能（BP）进行富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。以P＜0.05 为阈值，完成关键靶点富集分析。通过微生信（http://bioinformatics.com.cn）平台得出相应的富集结果，根据P值将前20 个结果绘制气泡图和通路气泡图。

1.6 药物与试剂

补骨脂乙素（质量分数≥98%，货号20784-50-3）购自大连美仑生物技术有限公司；二甲双胍（质量分数≥99%，货号1115-70-4）购自大连美仑生物技术有限公司；棕榈酸（质量分数97%，货号57-10-3）购自上海麦克林生化科技股份有限公司；DMEM 高糖液体培养基[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号11995065]；DMEM 无糖培养基[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号11966025]；胎牛血清（FBS）[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号C0232]；胰岛素（货号11061-68-0）购自大连美仑生物技术有限公司；荧光D-葡萄糖类似物2-NBDG（货号186689-07-6）购自武汉安捷凯生物医药科技有限公司。

Western 及IP 细胞裂解液（碧云天生物技术有限公司，货号P0013J）；胰岛素受体（INS-R）抗体（ImmunoWay Biotechnology Company，货 号YT2361）；胰岛素受体底物1（IRS1）抗体（沈阳万类生物科技有限公司，货号WL03123）；磷脂肌醇-3-激酶（PI3K）抗体（CellSignaling Technology,Inc，货号4257S）；蛋白激酶B（Akt）抗体（Proteintech Group,Inc，货号10176-2-AP）；Anti-葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）Rabbit pAb（沈阳万类生物科技有限公司，货号WL03363）。

1.7 胰岛素抵抗细胞模型的建立、剂量确定及分组

1.7.1 胰岛素抵抗细胞模型的建立 HepG2 细胞培养条件：DMEM 培养基＋10%胎牛血清＋1%青-链霉素，置于37 ℃、5% CO2培养箱。细胞贴壁培养，当细胞密度约为90%时，计数传代于6 孔板培养皿中，进行后续实验。在细胞生长处于对数期时，通过无糖DMEM 培养基饥饿细胞12 h，接着用200 μmol/L 棕榈酸处理细胞24 h。

1.7.2 细胞活性的检测 按照1×104HepG2 个细胞/mL（100 μL/孔）的密度将细胞接种于96 孔培养板。设置对照组、DMSO 组、补骨脂乙素（4、8、10、12、14 μmol/L）组，每组7 个复孔。加药物处理24 h 后，弃培养液，PBS 洗涤2 遍，使用DMEM培养基按照1∶10 比例稀释CCK8 试剂，加CCK8后置于培养箱中作用30 min。后用酶标仪（TECAN）检测细胞在450 nm 处A值。

1.7.3 2-NBDG 检测细胞对葡萄糖的摄取 按照1×104个细胞/mL（100 μL/孔）的密度将细胞接种于96 孔培养板。设置对照组、模型组、补骨脂乙素组、二甲双胍组，每组7 个复孔。模型组、补骨脂乙素组、二甲双胍组细胞按1.7.1 项下方法进行胰岛素抵抗诱导。补骨脂乙素组和二甲双胍（200 μmol/L）组在胰岛素抵抗模型基础上分别加药物处理24 h 后，弃培养液，PBS 洗涤2 遍，更换为含有1×10-6mol/L 胰岛素的无糖DMEM 培养基处理10 min，更换至含50 nmol/L 2-NBDG 的无糖的DMEM培养基培养30 min 后PBS 清洗2 次，最后每孔加100 μL PBS 溶液，用酶标仪（TECAN）检测细胞在475、550 nm 处的A值。

1.7.4 细胞的分组及加药处理 胰岛素抵抗细胞细胞模型随机分为模型组、二甲双胍组、补骨脂乙素组。二甲双胍组用200 μmol/L 二甲双胍处理24 h，补骨脂乙素组用10 μmol/L 补骨脂乙素处理24 h，正常培养条件的HepG2 细胞作为对照组。

1.8 总RNA 提取和浓度测定

6 孔板每孔细胞中加入1 mL Trizol 裂解液，冰上裂解15 min；加200 μL 三氯甲烷剧烈振荡，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液；加入与上清等体积的异丙醇后混匀，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min 后弃上清液；加DEPC 水配制的75%乙醇洗涤RNA 沉淀；4 ℃、7 500 r/min 离心5 min 后弃上清液；RNA 沉淀晾至透明，根据沉淀的体积加适量DEPC 水充分溶解RNA。通过DEPC 水空白检测，通过Nano 仪器（Nanodrop，美国）检测RNA 浓度，260、280 nm 的吸光度（A）比值需在1.8～2.1。

1.9 RT-PCR 法检测 PI3K/Akt 信号通路相关mRNA 的水平

使用高容量cDNA 逆转录试剂盒（Vazyme，HiScript®III.RT SuperMix）将RNA 逆转成cDNA用于qPCR，在QuantStudio 3 Flex 实时荧光定量PCR 系统（美国Thermo Fisher 公司）检测相对基因表达，将mRNA 水平归一化至Actin 表达水平，数据按qRT-PCR 荧光定量数据分析法计算2-ΔΔCt。检测模型组与对照组细胞中PI3K/Akt 信号通路指标mRNA 含量，并检测补骨脂乙素干预后的变化。

1.10 Western blotting 检测PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的水平

细胞加药处理结束后加入 RIPA 裂解液、Cocktail 冰上裂解30 min 后将细胞碎片混悬液转移到离心管中，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清装至离心管中以待检测。使用BCA 蛋白质定量试剂盒测定蛋白含量。取适量上清，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，95 ℃蛋白变性10 min。电泳后，转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗（INS-R 按1∶1 000 稀释，IRS1 按1∶1 500 稀释，GLUT2 按1∶1 000 稀释，PI3K 按1∶500 稀释，p-PI3K 按1∶500 稀释，Akt 按1∶1 000 稀释，p-Akt按1∶1 000 稀释，Actin 按1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜后TBST 溶液洗3 遍，加入二抗（按1∶20 000 稀释），室温孵育1 h。TBST 溶液3 遍，使用ECL 试剂盒进行显影。以Actin 为内参，计算INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相对表达量。

1.11 统计学方法

使用GraphPad Prism9 软件用于所有数据分析，数据以表示。使用双尾、未配对的Student T检验来评估两组之间的统计学意义，使用单因素方差分析（单因子方差分析）。

2 结果

2.1 补骨脂乙素抗2 型糖尿病的相关靶点

通过PubChem 数据库获取补骨脂乙素的化学结构。从ECTM 数据库、Swiss Target Prediction 数据库和结合文献挖掘方法收集到的基因删除重复项后，共得到100 个相关靶点；利用GeneCards 数据库获取了与2 型糖尿病相关的靶点共8 279 个。将收集到的补骨脂乙素靶点与2 型糖尿病疾病靶点交互分析，结果表明，补骨脂乙素对应的靶点中有92 个与2 型糖尿病有关，见图1。

图1 补骨脂乙素作用靶点与2 型糖尿病疾病靶点相互取交集情况Fig.1 Intersection between isobavachalcone target and type 2 diabetes target

2.2 PPI 分析结果

将92 个重叠基因进一步拟合到STRING 中，PPI 网络（交互得分≥0.150），包含补骨脂乙素和2型糖尿病的共同目标的86 个节点和379 个“边”（图2）。Cytoscape 3.9.1 软件中插件MCODE 分析了具有MCODE 默认值的整个网络，这产生了3 个Score＞5 的模块，即集群1（节点：16，得分：6.8）（图3A），集群2（节点：16，得分：6.4）（图3B），集群3（节点：6，得分：5.2）（图3C）。其中使用Cytohubba 和最大团中心性（MCC）算法作为潜在目标预测的过滤条件，筛选了从2 个聚类中提取的前38 个节点（图3D～F）。在MCODE 和Cytohubba的筛选结果交叉后，获得了35 个共同靶点，其中包括常见的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚单位α 基因（PIK3CA）、丝裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、酪氨酸激酶受体2（ERBB2）、低氧诱导因子-1（HIF1A）、间质表皮转化因子（MET）、碳酸酐酶9（CA9）等。

图2 药物与疾病共同靶点的PPI 网络图Fig.2 PPI network diagram of drug and disease common targets

图3 补骨脂乙素治疗2 型糖尿病核心靶点的筛选Fig.3 Screening of core targets of isobavachalcone for the treatment of type 2 diabetes

2.3 GO 分析和KEGG 富集分析结果

有177 个BP、28 个CC、54 个MF 和113 个KEGG 途径满足P＜0.05 的条件。KEGG 途径富集分析揭示了与2 型糖尿病治疗靶点密切相关的途径，包括PI3K/Akt 信号通路、胰岛素信号通路和2型糖尿病信号通路。在BP 分析中，靶基因主要富集于信号转导、蛋白磷酸化的调节、参与跨膜受体酪氨酸激酶信号通路的调节以及炎症反应的调节等。核膜、质膜和细胞器包膜内腔被发现参与CC富集分析，MF 分析发现靶点参与结合SH2 结构域激活激酶活性、结合ephrin 受体参与细胞增殖活动以及氧化还原反应，见图4。

图4 补骨脂乙素35 个潜在治疗2 型糖尿病靶点的GO 富集和KEGG 途径富集分析Fig.4 GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of isobavachalcone 35 potential therapeutic targets for type 2 diabetes

2.4 体外实验验证

2.4.1 补骨脂乙素最佳刺激浓度筛选 为了探寻补骨脂乙素最佳作用浓度，使用0、4、8、10、12、14 μmol/L 补骨脂乙素作用HepG2 细胞24 h，检测细胞活力，与对照组相比，当补骨脂乙素浓度为4、8、10 μmol/L 时，细胞活力均没有下降，当浓度为12 μmol/L 时，细胞活力开始有显著下降趋势（P＜0.05），因此选择干预浓度为4、8、10 μmol/L。当补骨脂乙素浓度为10 μmol/L 时能显著提高模型细胞的葡萄糖摄取能力（P＜0.01），因此后续研究选用补骨脂乙素的干预浓度为10 μmol/L，见图5。

图5 补骨脂乙素对HepG2 细胞活力及葡萄糖摄取能力的影响（，n=3）Fig.5 Effect of isobavachalcone on HepG2 cell viability and glucose uptake capacity (,n=3)

2.4.2 补骨脂乙素对胰岛素抵抗细胞葡萄糖摄取能力的影响 与对照组相比，模型组HepG2 细胞摄取2-NBDG 的荧光强度显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，二甲双胍组和补骨脂乙素组细胞荧光强度显著增强（P＜0.01）。二甲双胍组和补骨脂乙素组显著提高了棕榈酸处理细胞后葡萄糖的摄取能力，见图6。

图6 葡萄糖的摄取能力的检测结果（，n=3）Fig.6 Detection of 2-NBDG (,n=3)

2.5 补骨脂乙素对胰岛素抵抗细胞模型PI3K/Akt信号通路相关基因mRNA 表达的影响

与对照组相比，模型组INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、AktmRNA 水平均显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。补骨脂乙素组INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、AktmRNA 的表达水平显著高于模型组（P＜0.01、0.001），见图7。

图7 补骨脂乙素对胰岛素抵抗细胞模型PI3K/Akt 信号通路相关基因mRNA 表达的影响（，n=3）Fig.7 Effect of isobavachalcone on mRNA expression of PI3K/AKT signaling pathway in insulin resistant cell model (,n=3)

2.6 补骨脂乙素对胰岛素抵抗细胞模型PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组处理显著降低了INS-R、IRS1、GLUT2、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K 蛋白表达（P＜0.05、0.001）。与模型组相比，二甲双胍组和补骨脂乙素组的INS-R、IRS1、GLUT2、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K 的蛋白表达显著上调（P＜0.01、0.001），见图8。

图8 补骨脂乙素对胰岛素抵抗细胞模型PI3K/Akt 信号通路蛋白表达的影响（，n=3）Fig.8 Effect of isobavachalcone on protein expression of PI3K/Akt signaling pathway in insulin resistant cell model (,n=3)

3 讨论

2 型糖尿病是多基因、多因素作用的疾病，仅根据单一作用靶点难以达到良好的治疗效果[19]。中药或天然药物具有多成分、多靶点的特点，被视为药物开发的重要来源[20]。由于中药成分复杂且涉及靶点较多，从多成分中寻找具有潜在开发价值的天然产品通常具有挑战性。网络药理学作为一种新的方法，从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物与疾病之间的靶点网络[21]。补骨脂乙素是补骨脂中的黄酮类的化合物，补骨脂乙素可以抑制NF-κB 通路改善大鼠糖尿病肾病，抑制肾脏炎症，改善肾损伤[22]，表明补骨脂乙素与2 型糖尿病有一定的相关性。但补骨脂乙素在2 型糖尿病中的作用效果及机制仍需进一步的研究。

通过补骨脂乙素作用靶点与2 型糖尿病靶点的交集得到多个重叠的基因及核心靶点，PPI 显示补骨脂乙素作用于2 型糖尿病的靶蛋白之间具有密切的相互作用，KEGG 分析表明靶基因富集在PI3K/Akt 信号通路，GO 分析表明补骨脂乙素治疗2 型糖尿病的核心靶点参与PI3K 酶活性及PI3K 复合物的形成，表明PI3K/Akt 在补骨脂乙素治疗2 型糖尿病机制可能起着重要的作用。PI3K/Akt 及其相关信号通路在生物体生长和关键BP（如葡萄糖稳态、脂质代谢、蛋白质合成和细胞增殖和存活）中起着关键的作用[23]。在血糖调节过程中，胰岛素与靶细胞膜上的胰岛素受体（IR）结合促进IRS-1 磷酸化，IRS1 通过SH2 结构域激活PI3K，PI3K 与下游效应物Akt 结合并激活其表达，进一步导致GLUT4 易位至细胞膜，增加细胞对葡萄糖的摄取，调节血糖平衡[24]，GLUT4 表达的改变会导致葡萄糖摄取或输出障碍，导致胰岛素抵抗的发生[25]。补骨脂乙素的潜在靶点与2 型糖尿病靶点的交集中均发现PI3K/Akt 通路相关靶点，如PIK3CA、磷酸肌醇-3-激酶催化亚基β 肽（PIK3CB）、mTOR 等。PI3K/Akt 通过下游叉头框蛋白O1（FOXO1）和糖原合成酶激酶3（GSK3）调节葡萄糖代谢，通过mTOR 蛋白复合体1（mTORC1）和固醇调节元件结合蛋白（SREBP）调节脂质代谢[26]。KEGG 富集分析中发现补骨脂乙素靶点也富集在PI3K/Akt 下游FOXO 和mTOR 信号通路。本研究利用细胞实验对网络药理学预测结果PI3K/Akt 信号通路进行了验证。

实验结果显示，胰岛素抵抗细胞经补骨脂乙素处理后，胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取能力明显增强，胰岛素抵抗细胞中PI3K、Akt、INS-R、IRS1的mRNA 显著升高，与葡萄糖摄取相关的GLUT2mRNA 表达水平也显著增加。PI3K 和Akt 蛋白及其磷酸化也显著升高，INS-R、IRS1、GLUT2 的蛋白表达水平与转录水平表达趋势一致，说明补骨脂乙素通过PI3K/Akt 信号通路增加葡萄糖的摄取改善胰岛素抵抗，从而发挥抗2 型糖尿病的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学及细胞生物学技术对补骨脂乙素靶点及作用通路进行分析，表明补骨脂乙素治疗2 型糖尿病是多成分、多靶点、多途径协同作用的结果。补骨脂乙素可能通过PI3K/Akt 信号通路发挥对2 型糖尿病的治疗作用，为其后续进一步深入研究提供了基础和参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突