何银,陈红梅,陈晨,潘艳丽,米雪,胡志林*
1.石河子大学 药学院,新疆植物药资源利用教育部重点实验室,新疆 石河子 832003
2.新疆华世丹药业有限公司,新疆 乌鲁木齐 830001
幽门螺杆菌(Hp)是一种微需氧革兰阴性杆菌,主要定植于胃和十二指肠。Hp 在人群中主要通过口-口途径传播,目前全球Hp 感染率已超过50%,我国自然人群Hp 感染率在59%[1-2]。Hp 感染与多种人类上消化道疾病有关,感染的患者一般患有慢性活动性胃炎,其中10%~20%可发展为消化性溃疡,50%可发展为胃黏膜萎缩,1%~3%甚至可发展为胃癌或胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤[3-4]。随着Hp治疗的广泛开展,根除率逐渐降低,有效治疗Hp 感染面临着挑战,Hp 耐药性是导致幽门螺杆菌根除率越来越低的主要原因[5]。根除Hp 是消除慢性胃炎、预防和治愈消化性溃疡、有效治疗MALT 淋巴瘤、降低胃癌发病率最经济、有效的方法[6]。
大蒜是亚洲种植最广泛的蔬菜作物之一,也是世界闻名的药用植物。大蒜中至少含有33 种硫化物,硫化物是使大蒜产生刺激性气味、发挥药理作用的主要成分[7-9]。大蒜素是大蒜中的主要生物活性成分,具有抗癌、抗炎、抗氧化、免疫调节、抗血小板聚集、心肌保护、心血管保护、消化系统保护等生物学功能[10-13]。大蒜素具有较强的抗菌活性,抑制Hp 的生长,有效预防和减少Hp 的感染,还在临床上对系统性真菌和细菌感染有良好的治疗效果[14-16]。本研究将基于网络药理学、分子对接和体外抑菌试验研究大蒜治疗Hp 感染可能的活性成分、靶点和通路,探讨其作用机制,为后续研究提供参考。
1.1.1 药物活性成分靶点的收集 在HERB数据库检索“大蒜”并下载相关成分表,并通过相对分子质量(MW)≤500,脂水分配系数(xlogp)≤5,氢键给体数目(H-bond donors)≤5,氢键受体数目(Hbond acceptors)≤10 筛选其活性成分,再通过PharmMapper、Swiss Target Prediction、BATMANTCM 数据库(Score cutoff≥20,P<0.05)收集大蒜活性成分相关靶点。利用Cytoscape 3.9.1 软件制作“药物-成分-潜在靶点”网络图。
1.1.2 疾病靶点收集 以“Helicobacterpyloriinfection”作为关键词,在GeneCards(Relevance score≥5)、OMIM、DRUGBANK、DisGeNET 数据库进行检索,将结果合并去重后得到Hp 感染相关靶点。将活性成分靶点与疾病靶点导入Venny 2.1 在线工具,获取大蒜治疗Hp 感染的潜在作用靶点。
1.1.3 构建蛋白相互作用(PPI)网络 将1.1.2 项下得到的潜在作用靶点导入STRING 数据库,设置物种为“Homo sapiens”,最小相互作用阈值设定为“highest confidence(0.900)”,即可得到PPI 网络。将分析结果的tsv 文件导入Cytoscape 3.9.1 软件进行可视化,得到最终的PPI 网络图,并筛选出degree值最大的前5 个节点,作为核心靶点。
1.1.4 基因本体论(GO)生物分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析 将交集靶点导入DAVID 数据库进行GO 功能富集分析及KEGG信号通路分析,将所得结果按P值升序排列(P<0.05),然后通过微生信在线绘制工具,分别取生物功能(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF)的前15 位绘制GO 功能富集柱状图,KEGG 信号通路富集结果取前30 位绘制KEGG 通路气泡图。
1.1.5 活性成分与核心靶点的分子对接 在TCMSP 数据库中获取大蒜有效成分的MOL2 结构文件,在Autodock Tools 1.5.7 软件中加氢后导出为“pdbqt 文件”。然后在PDB 数据库中根据物种、方法、分辨率、Macromolecule 筛选核心靶点蛋白结构,保存其“pdb 格式文件”,并通过Pymol 软件进行去水分子、去配体,Autodock Tools 中加氢后导出“pdbqt 文件”。最后,将配体小分子和受体大分子一起导入Autodock Tools 软件中,计算得到相应的结合能数据。
1.2.1 实验菌株 Hp 标准菌株ATCC 700392(北京北纳创联生物技术研究院);Hp 标准菌株ATCC 43504(新疆华世丹药业有限公司);Hp 临床菌株SS1(北京北纳创联生物技术研究院)
1.2.2 试剂与耗材 大蒜素(质量分数95.22%,批号210517,江苏正大清江制药有限公司);哥伦比亚琼脂培养基(批号Cat.No.10106,青岛日水生物技术有限公司);布氏肉汤(批号Cat.No.10705,青岛日水生物技术有限公司);脱纤维山羊血(无菌)(批号TX0020,北京索莱宝科技有限公司);胎牛血清(批号21100702,浙江天杭生物科技股份有限公司);HP 尿素酶快速检测试剂盒(干化学法)(批号20142400023,本溪泰斯特捷生物科技有限公司);HP 试纸(化学反应法)(批号20192400204,珠海市克迪科技开发有限公司);日本三菱MGC 产气袋(批号1198LJ-1,北京缘生化科技有限公司)。
1.2.3 仪器 BSC-1300II A/B3 生物安全柜(上海博讯实业有限公司);SPX-250B-Z 生化培养箱(上海博讯实业有限公司);KXQ.SG46.280 高压灭菌锅(上海佳腾实验设备有限公司);JM300/0.1 电子天平(余姚纪铭称重校验设备有限公司)。
1.2.4 菌株的培养及鉴定 取100 μL 菌液涂布于含有10%无菌脱纤维山羊血的哥伦比亚琼脂平板上,倒置于厌氧菌培养盒内(培养条件:5% O2、10% CO2、85% N2),将培养盒放入37 ℃细菌培养箱培养3 d,经革兰氏染色和尿素酶实验证实为Hp。取鉴定后菌株,采用接种环挑取1 CFU Hp 菌落接种于100 mL 含10%胎牛血清布氏肉汤培养基中,微需氧环境中培养3 d,取100 μL 细菌悬液重悬于10 mL 无菌水中,进行麦氏比浊,稀释菌液浓度为1.0×108CFU/mL,用于药敏实验。
1.2.5 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用液体倍比稀释法测定大蒜素对Hp 的MIC 值,用布氏肉汤培养基配制成512 μg/mL 的大蒜素母液,取13 根10 mL 无菌试管,依次编号1~13。实验组1~11 号管分别配制成浓度为0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL 的系列药液,然后分别加入0.1 mL 1×108CFU/mL 菌悬液(试管中最终菌悬液浓度为1×106CFU/mL)。12 号管作为阳性对照管不加药液,13 号管作为阴性对照管不加菌液,混匀后置于37 ℃细菌培养箱中培养3 d。没有细菌生长的最小药物浓度为该药的MIC 值。
共得到大蒜活性成分共36 个,见表1。在PharmMapper、Swiss Target Prediction、BATMANTCM 数据库共获取大蒜活性成分潜在靶点1 170个,将大蒜对应的活性成分以及潜在靶点、药物构建“药物-成分-潜在靶点”网络,见图1。网络中共含有节点1 207 个,边线6 833 条。所有活性成分节点中degree 值最大的前10 位是二烯丙基二硫醚、对羟基苯甲酸乙酯、山柰酚、芹菜素、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基四硫醚、香叶醇、大蒜素、香橙醛、二烯丙基三硫醚,是大蒜治疗Hp 感染主要活性成分,其中二烯丙基二硫醚、二烯丙基四硫醚、二烯丙基三硫醚是大蒜素中的活性成分。
图1 “药物-成分-潜在靶点”网络Fig.1 Network of “drugs-components-potential targets”
表1 大蒜活性成分基本信息Table 1 Basic information of Allium sativum active ingredients
Genecards、OMIM、DRUGBANK、DisGeNET数据库筛选获得1 584 个疾病靶点,将这些疾病靶点与药物活性成分靶点取交集,共获得291 个大蒜治疗Hp 感染的潜在作用靶点,见图2。
图2 药物靶点与疾病靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of drug target and disease target
PPI 网络见图3。网络中共含有节点246 个,节点面积越大,颜色越深,代表该节点的degree 值越大;1 416 边线条,代表靶点蛋白之间的相互关联。根据degree 值筛选前5 个节点为肿瘤蛋白p53(TP53)、酪氨酸蛋白激酶(SRC)、信号传导和转录激活蛋白3(STAT3)、热休克蛋白90α 家族A 类成员 1(HSP90AA1)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK3),这5 个靶点被认为是大蒜治疗Hp 感染的核心靶点,见图4。
图3 PPI 网络Fig.3 Network interaction map of PPI
图4 核心靶点相互作用网络Fig.4 Network interaction map of core targets
GO 富集分析结果表明,BP 分析富集影响较显著的有对药物的反应、凋亡过程的负调控、基因表达的正调控、对外源化合物刺激的反应、蛋白质磷酸化等;CC 分析富集影响较显著的有细胞溶质、细胞外间隙、细胞质、大分子复合物、胞外区等;MF分析富集影响较显著的是相同的蛋白质结合、酶结合、蛋白激酶活性、蛋白质结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等,见图5。KEGG 通路分析结果表明,大蒜治疗Hp 感染与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)、叉头框蛋白O(FoxO)、MAPK、低氧诱导因子-1(HIF-1)等多条信号通路密切相关,揭示大蒜可能通过靶向作用于这些通路介导Hp 感染过程,见图6。
图5 GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis
图6 KEGG 通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis
将大蒜的活性成分分别与核心靶点进行分子对接,对接结果见表2。分子对接的结合能越小,提示活性物质与蛋白质之间结合越牢固,其数值小于-1.2 kcal/mol(1 kcal=4.184 kJ)时表示活性物质与蛋白质之间有较好的结合活性[17]。结果表明,大蒜degree 值前10 位的活性成分与核心靶点的结合能均具有较好的结合活性,而且结合体构象稳定。
表2 分子对接结果Table 2 Molecular docking results
对大蒜素进行体外抗Hp 活性检测,大蒜素对3 株Hp 菌等抑制能力不同,对Hp ATCC 43504 的MIC 值为2.0 mg/mL,对Hp SS1 和Hp ATCC 700392的MIC 值均为4.0 mg/mL,表明大蒜素对Hp 菌株具有抑制作用,其MIC 值越小说明抗菌活性越强。
本研究利用网络药理学和分子对接,对大蒜治疗Hp 感染的机制进行分析。“药物-成分-潜在靶点”网络分析得到,degree 值前10 位的大蒜活性成分为二烯丙基二硫醚、对羟基苯甲酸乙酯、山柰酚、芹菜素、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基四硫醚、香叶醇、蒜辣素、香橙醛、二烯丙基三硫醚。其中二烯丙基二硫醚、二烯丙基四硫醚、二烯丙基三硫醚是大蒜素中的活性成分,二烯丙基三硫醚为大蒜素的主要活性成分。二烯丙基二硫醚是大蒜中degree值最高的一种活性成分,可以同时抑制敏感和耐药的Hp[18]。二烯丙基三硫醚可以破坏Hp 生物膜结构,起到杀菌作用,且随着药物浓度的提高,杀菌效果逐渐增强,而且二烯丙基三硫醚比二烯丙基二硫具有更高的抗Hp 活性[19-20]。因此,对大蒜素进行了体外抑菌试验,发现大蒜素对三株幽门螺杆菌均具有抑菌作用,最小抑菌浓度为2.0 mg/mL。
通过PPI 网络分析可知,TP53、SRC、STAT3、HSP90AA1、MAPK3 是大蒜对抗Hp 感染的核心靶点。TP53 是一种与肿瘤的增殖、分化等过程密切相关的抑癌基因,TP53 突变可引起p53 核蓄积,与Hp 感染诱发的胃黏膜AID 异常表达密切相关,且TP53 基因Pro/Pro 基因型可增加Hp 感染者胃癌发生的风险[21-22]。STAT3 是许多细胞因子和生长因子的关键转录因子,可诱导HIF-1α 表达,进而促进细胞迁移、侵袭和肿瘤形成[23-24]。
KEGG 通路富集分析表明,大蒜抗Hp 感染与PI3K-Akt、FoxO、MAPK、HIF-1 等信号通路密切相关。Hp 可以通过激活PI3K-Akt 信号通路来调节Hp 诱发的细胞迁移,与宿主细胞cag 分泌系统和肽聚糖以及表皮生长因子受体(EGFR)反式激活和SRC 活化有关[25]。FoxO 与细胞凋亡、细胞周期阻滞、氧化应激等密切相关,FoxO3a 可通过调控其下游物靶基因参与Hp 所致胃黏膜相关疾病的发生发展过程,且FoxO1/3a 是Hp 诱导的PI3K/Akt 细胞生存信号通路的新型核底物,该信号通路可控制白细胞介素-8(IL-8)的产生[26-27]。MAPK 通路在炎症、氧化应激、细胞增殖等生理病理过程和应激反应中起到重要作用,Hp 感染后引起的胃黏膜炎性损伤可通过MAPKs 信号转导通路完成[28-29]。HIF-1 是一种缺氧诱导因子,Hp 可通过上调HIF-1α 和STAT3 的表达可促进胃上皮细胞GES-1 的增殖、侵袭和迁移[30]。
通过分子对接发现,大蒜degree 值前10 位的活性成分与核心靶点的结合能均具有较好的结合活性,而且结合体构象稳定。提示大蒜中的这些成分可能通过调控核心靶点参与Hp 感染相关过程。
综上所述,大蒜治疗Hp 感染的机制可能是通过二烯丙基二硫、二烯丙基三硫醚等烯丙基硫醚类化合物作用于TP53、SRC、STAT3、HSP90AA1、MAPK3 等核心靶点,与PI3K-Akt、FoxO、MAPK、HIF-1 等信号通路有关。通过初步抑菌试验,验证了大蒜素抗Hp 的活性,为后续研究提供理论依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突