黑豆种皮花青素的提取工艺优化及抗氧化活性研究

温文君，李 森，李鑫鹏，李占蓉

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030801）

花青素是一类多羟基酚类物质，在黑豆种皮中总花青素含量较高[1-2]。抗氧化能力是黑豆种皮花青素许多重要生理功能的基础[3]，研究表明，花青素在较低剂量时可以直接清除活性氧，具有较好的抗氧化作用[4-5]，基于此，可将其作为安全无毒的抗氧化剂应用于多种行业中[6]。由于黑豆的可直接食用性和抗氧化性，将其制成保健品成为研究开发的热点方向。目前市场上已开发出一些生血养血和护眼明目的黑豆保健食品[7]。此外，黑豆种皮的花青素还可以作为天然着色剂和防腐剂应用于各种食品中[8]，既能保障食用安全性，又具有较高的营养价值。

目前对植物中花青素的提取方法已有大量的研究，常用的花青素提取法一般有溶剂提取法、超声波提取法、酶提取法和微波辅助提取法等[9]。其中溶剂提取法具有操作安全的特点，但同时也具有提取时间长、溶剂消耗量大、成本高等缺点[10-11]；超声波提取法具有浸提温度低、时间短、速度快和节约溶剂且无污染的优点，但提取过程会产生噪音[12-13]；酶提取法反应条件温和、无有机溶剂残留且提取率较高，但是能耗成本及对试验精准度的要求均较高[14-15]；微波辅助提取操作简单、选择性多、提取时间短、效率高[16-18]。综合来看，微波辅助提取法可缩短提取时间，减少热损失，且适用范围较广，试验更加便利。花青素在较高温度下会发生分解，影响其抗氧化活性，降低其应用价值[19-21]。因此，在优化花青素提取条件时还需要考虑对抗氧化活性的影响。

黑豆种皮中花青素含量丰富，为了进一步开发黑豆中花青素资源，本研究采用微波辅助提取法，在单因素试验的基础上，通过正交试验对花青素提取工艺进行优化，并通过测定其不同提取条件下的抗氧化性，进一步优化提取温度，为黑豆种皮的合理开发及黑豆种皮花青素的深入研究和应用提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

黑豆种皮（已脱壳），购于本地超市；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、水杨酸、过硫酸钾，上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、抗坏血酸，天津市致远化学试剂有限公司；H2O2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；FeSO4、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），上海晶纯生化科技股份有限公司；2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），罗氏集团。

1.1.2 仪器与设备

DHG-9023A 型台式干燥箱，浙江和呈科学仪器公司；ESW-1.0 实验室粉碎磨，上海易勒机电有限公司；ZX-S24电热恒温水浴锅，苏州力意达仪器科技有限公司；Heraeus Multifuge X1R 离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UV-1100 紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺

将黑豆种皮粉碎，过40目筛，称取1.0 g黑豆种皮粉置于离心管中，加入体积分数为60%的乙醇溶液20 mL，350 W 微波处理30 s 后，40 ℃恒温水浴提取30 min。

1.2.2 标准曲线的绘制

称取10 mg 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，配制成0.1 mg/L 的标准溶液。分别取标准溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，并用60%乙醇定容至10 mL的容量瓶中，然后进行30 ℃恒温水浴10 min。使用紫外可见分光光度计在520 nm处测定待测溶液的吸光度。以花青素质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线:y=3.458 8x-0.035 5，R2=0.992 1。

1.2.3 花青素提取量的计算

称取1.0 g黑豆种皮粉末，以60%乙醇为提取剂，在不同试验条件下进行花青素提取，以4 000 r/min离心10 min，取上清液在520 nm 处测定吸光度，根据“1.2.2”中的标准曲线计算提取液中花青素质量浓度（C），花青素含量（mg/g）以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量计，计算公式如下：

其中：C 为花青素浓度（mg/mL）；V 为提取体系体积（mL）；n为稀释倍数；m为黑豆种皮原料质量（g）。

1.2.4 微波辅助提取单因素试验

1.2.4.1 乙醇体积分数的筛选

固定黑豆粉质量和乙醇体积比（料液比）为1∶20（g/mL），350 W微波30 s，40 ℃恒温水浴提取30 min，设置乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%，以花青素提取量为指标筛选提取溶剂体积分数。

1.2.4.2 料液比的筛选

固定乙醇体积分数60%，350 W微波30 s，40 ℃恒温水浴提取30 min，设置料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），以花青素提取量为指标筛选提取料液比。

1.2.4.3 提取时间的筛选

固定料液比1∶20（g/mL），乙醇体积分数60%，350 W 微波30 s，40 ℃恒温水浴，设置水浴时间分别为20、30、40、50、60 min，以花青素提取量为指标筛选提取时间。

1.2.4.4 微波时间的筛选

固定料液比1∶20（g/mL），乙醇体积分数60%，350 W 微波不同时间（10、20、30、40、50 s），40 ℃恒温水浴30 min，以花青素提取量为指标筛选微波时间。

1.2.4.5 提取温度的筛选

固定料液比1∶20（g/mL），乙醇体积分数60%，350 W微波30 s，设置提取温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃，恒温水浴30 min，以花青素提取量为指标筛选提取温度。

1.2.5 正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取提取温度（A）、提取时间（B）、微波时间（C）、乙醇体积分数（D）、料液比（E）为影响因素，以黑豆种皮花青素提取量为考察指标，进行L16(45)正交试验，因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 花青素抗氧化活性的测定

1.2.6.1 羟基自由基清除能力

参考高洁等[22]的方法。配制一系列质量浓度梯度的黑豆种皮花青素溶液（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL），取不同质量浓度待测液2 mL，按顺序加入2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L 乙醇-水杨酸溶液，最后加入2 mL 8.8 mmol/L H2O2后摇匀，在37 ℃恒温水浴15 min 后取出，使用紫外可见分光光度计测定待测溶液在510 nm处的吸光度（A1），设置对照（A2）和空白（A0），以VC为阳性对照。清除率计算公式为：

1.2.6.2 DPPH自由基清除能力

参考高洁等[22]的方法。用无水乙醇配制浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液，避光保存，现配现用。配制质量浓度分别为0.001、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040 mg/mL 的黑豆种皮花青素溶液，取不同质量浓度待测液0.5 mL，加入0.5 mL配制好的DPPH乙醇溶液，摇匀，室温避光静置反应30 min，使用紫外可见分光光度计在517 nm处测量待测溶液的吸光度（A1），设置对照（A2）和空白（A0），以VC为阳性对照。清除率计算公式见“1.2.6.1”。

1.2.6.3 ABTS自由基清除能力

参考林好等[23]的方法。配制试剂Ⅰ：准确称取0.038 4 g ABTS，用蒸馏水定容至10 mL；配制试剂Ⅱ：称取0.013 4 g 过硫酸钾，用蒸馏水定容至10 mL；将试剂Ⅰ与试剂Ⅱ等量混合，避光反应12～16 h 后得ABTS工作液，使用前用无水乙醇稀释至在734 nm 处测得吸光度为0.70，然后取黑豆种皮花青素配制成质量浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL 的溶液，取0.15 mL 样品溶液和2.75 mL ABTS 工作液混合均匀，置于37 ℃恒温水浴锅中避光反应20 min，使用紫外可见分光光度计在517 nm 处测定待测溶液的吸光度（A1），设置对照（A2）和空白（A0）。清除率计算公式见“1.2.6.1”。

1.2.7 数据处理

数据采用Microsoft Excel 2016 进行分析，并采用Origin Pro 8.5作图，采用SPSS 22中的ANOVA结合Duncan’s检验对不同处理组之间的差异进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 花青素提取单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对花青素提取量的影响

花青素的结构中含有多个羟基，具有很强的极性，因此易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂[24]。由于本研究是针对花青素在食品中的应用，乙醇的生物毒性低于甲醇，因此试验选择不同体积分数的乙醇水溶液进行提取溶剂的优化，结果如图1所示。当提取剂中乙醇体积分数由40%升高到60%时，花青素提取量随之升高；在乙醇体积分数为60%时，提取量达到最高，之后花青素提取量呈现出随乙醇体积分数的增加而降低的趋势。这可能是由于乙醇体积分数增加，造成极性减小，花青素溶解度降低，且伴随有大量的醇溶性蛋白质、多糖等大分子物质析出，影响花青素提取量[25]。因此，以体积分数为60%的乙醇溶液为基础提取溶剂设计正交试验。

图1 乙醇体积分数对花青素提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of anthocyanin

2.1.2 料液比对花青素提取量的影响

由图2 可见，随着提取溶剂用量的增加，花青素提取量逐渐提高，料液比为1∶20（g/mL）时达到最高，之后逐渐降低。花青素从细胞中溶出是通过扩散作用实现，当提取溶剂用量增加时，黑豆种皮细胞内外浓度差变大，扩散作用增强，花青素提取量增加[26-27]，但提取溶剂过多时，花青素在后续的富集浓缩过程中损失增加，导致提取量下降。因此，以1∶20（g/mL）为基础料液比设计正交试验。

图2 料液比对花青素提取量的影响Fig.2 Effect of material to solvent ratio on the extraction of anthocyanin

2.1.3 提取时间对花青素提取量的影响

较长的提取时间有助于溶剂和样品之间的相互作用，提高花青素提取量，但过长的提取时间易导致花青素在空气中氧化分解，提取量随之下降，同时也会造成资源的浪费。如图3所示，黑豆种皮经过微波处理之后，花青素更加容易溶出，在30 min时大部分花青素已经溶出，之后花青素提取量随着时间的延长而有所降低。因此，以30 min 为基础提取时间设计正交试验。

图3 提取时间对花青素提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of anthocyanin

2.1.4 微波时间对花青素提取量的影响

微波提取是通过偶极子旋转和离子传导同时作用于分子以实现花青素辅助提取。在微波作用过程中，它的能量可以被分子全部吸收，极性分子吸收能量后会破坏细胞结构，在热传递的辅助下有助于目标提取物的传质和溶出[28-29]。微波既可以节省提取时间，又能减少提取溶剂的使用量[30]。因此本试验采用微波对黑豆种皮进行预处理以提高花青素的提取量。如图4所示，当微波时间为10～30 s时，花青素提取量随时间的延长而升高，在30 s 时提取量最大，这是因为分子在微波中产生瞬时极化的同时迅速生成大量的热，造成细胞破裂，细胞液随之溢出并扩散至溶剂中。当微波时间继续增加时，花青素提取量则有所降低。长时间的微波处理会破坏花青素的结构，影响提取量。因此以30 s为基础微波处理时间设计正交试验。

图4 微波时间对花青素提取量的影响Fig.4 Effect of microwave time on the extraction of anthocyanin

2.1.5 提取温度对花青素提取量的影响

温度升高能够改变细胞膜的流动性，加速分子运动，导致细胞膜稳定性降低，使细胞容易破碎，因此在提取过程中适当的加热能够提高花青素的提取效率[31]。如图5 所示，随着提取温度的升高，花青素的提取量逐渐提高，适当的加热可以促进花青素的提取，但温度过高会破坏花青素的结构，影响其生理活性，因此在此试验结果的基础上，选择了30、40、50、60 ℃进行正交试验。

图5 提取温度对花青素提取量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction of anthocyanin

2.2 花青素提取正交试验结果与分析

正交试验结果如表2所示，由极差分析可知，各因素对黑豆种皮花青素提取量影响的主次顺序为：C＞D＞E＞A＞B。由表2可知，最高花青素提取量的组合为A4B2C3D4E2，即提取温度60 ℃，提取时间30 min，微波时间30 s，乙醇体积分数70%，料液比1∶15（g/mL），经3次验证试验，得到该最优组合下黑豆种皮中花青素平均提取量为29.5 mg/g，高于正交试验中各组合。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

2.3 不同提取温度对花青素抗氧化活性的影响

花青素的主要生理功能是抗氧化，因此在以花青素提取量为评价指标的同时还需要考虑提取条件对花青素抗氧化能力的影响，尤其是温度对花青素的结构可能产生破坏，因此在本试验中选择了3个指标对不同温度下提取的花青素进行抗氧化能力的评价，包括羟基自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力以及ABTS自由基清除能力。

2.3.1 花青素对羟基自由基的清除能力

羟基自由基是生物体内活性最强的自由基，能够攻击体内的生物大分子，导致体内多种疾病的发生。以VC作为对照，花青素对羟基自由基的清除能力如图6 所示。花青素对羟基自由基有一定的清除能力，在一定范围内存在量效关系，花青素质量浓度越高，清除能力越强。在低浓度时清除能力与VC无显著差异，随着浓度的增加，对羟基自由基的清除能力低于VC。在试验的质量浓度范围内，不同温度下提取的黑豆种皮花青素的羟基自由基清除能力由大到小排序为：40 ℃＞50 ℃＞60 ℃。结果表明，在温度较低的条件下提取的花青素对羟基自由基的清除能力更强。

图6 不同提取温度所得花青素对羟基自由基的清除作用Fig.6 The clearing effect of anthocyanins extracted at different temperatures on hydroxyl free radicals

2.3.2 花青素对DPPH自由基的清除能力

以VC为对照，黑豆种皮花青素对DPPH自由基的清除能力如图7 所示。在质量浓度低于0.02 mg/mL时，黑豆种皮花青素对DPPH 自由基的清除率比VC高。但不同温度下提取的黑豆种皮花青素对DPPH自由基的清除能力无显著差异。

图7 不同提取温度所得花青素对DPPH自由基的清除作用Fig.7 The clearing effect of anthocyanins extracted at different temperatures on DPPH free radicals

2.3.3 花青素对ABTS自由基的清除能力

黑豆种皮花青素对ABTS 自由基的清除能力如图8所示。黑豆种皮花青素质量浓度对ABTS自由基的清除能力存在一定的量效关系，在一定范围内，质量浓度越高清除能力越强，且40 ℃下提取的黑豆种皮花青素对ABTS 自由基的清除能力强于50 ℃和60 ℃，且在试验浓度范围内，40 ℃条件下提取的黑豆种皮花青素最先达到最高清除率（98.71%）。结果表明，黑豆种皮花青素对ABTS自由基有很强的清除能力，且提取温度越低，其清除能力越强。

图8 不同提取温度所得花青素对ABTS自由基的清除作用Fig.8 The clearing effect of anthocyanins extracted at different temperatures on ABTS free radicals

花青素在较高温度下会发生分解，影响其抗氧化活性，降低其应用价值[19-21]。通过对不同提取温度下得到的花青素抗氧化能力的评价，发现40 ℃提取的黑豆种皮花青素对羟基自由基和ABTS 自由基的清除能力更强，因此选择40 ℃作为最终的提取温度。在此温度下黑豆种皮花青素提取量为25.3 mg/g。

3 结论

本研究以黑豆种皮为原料，以花青素提取量和花青素抗氧化活性为考察指标，优化了黑豆种皮中花青素的提取条件。通过单因素试验和正交试验，分析了微波时间、料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度对黑豆种皮中花青素提取量的影响，并优化了最佳提取条件。通过黑豆种皮花青素抗氧化性试验结果发现，不同温度下提取的花青素抗氧化能力存在差异，在相同花青素质量浓度下，对羟自由基和ABTS自由基的清除能力由大到小排序为：40 ℃＞50 ℃＞60 ℃。最终确定微波辅助提取黑豆种皮花青素的最佳工艺为：乙醇体积分数70%，料液比1∶15（g/mL），微波功率350 W，微波时间30 s，提取时间30 min，提取温度40 ℃，此条件下花青素的提取量为25.3 mg/g。微波辅助提取黑豆种皮花青素具有温度低、时间短、效率高等优点。本研究可为黑豆中花青素的开发应用以及工业化生产提供理论依据。