牛奶中黄曲霉毒素常见检测方式及其危害分析

◎ 袁 莉

（吕梁市综合检验检测中心，山西 吕梁 033000）

为贯彻、响应并落实《食品安全法》《农产品质量安全法》等有关规定，保障动物产品质量与安全，对动物产品进行检验是必要的。在此过程中，相关检测部门必须深入基层，对动物产品安全检测站进行检测，对食用动物的肉、蛋、奶等进行检测，对输入动物的饲料、兽药、饲料添加剂等进行检测，对农场、屠宰场、奶站、贸易市场、超市等地方销售的动物产品品质进行检测，保障广大消费者的食品安全[1]。

1 理化性质

黄曲霉毒素M1 （AFM1）是由黄曲霉毒素B1（AFB1）经羟基化而形成的衍生物，其主要结构为二呋喃环氧化萘并酮，具有较高的热稳定性。AFM1为一种在365 nm UV照射下，显示出蓝紫发光的无色晶体，可溶于极性有机溶剂，但无法溶于非极性溶剂（如乙醚、石油醚、正己烷等）。除此之外，裂解仅在熔融时出现，其在中性和弱酸性环境下会非常稳定；在酸性环境下， pH值在1～3，会略微裂解，pH值在9～10，会很快裂解。AFT与碱性物质发生快速降解，在 pH值为9～10的情况下， AFT很快降解为基本无毒性盐类。所以，该化学反应可用于食物脱毒[2]。

2 检测方法

2.1 高效液相色谱法（HPLC）

世界范围内，最常用的 AFM分析技术是 HPLC。其基本原理是在对样本进行一定比例有机溶剂提取后，通过带有对应填料的纯化柱，除去其中杂质，经纯化处理后再进行浓缩干燥，进而在弱酸情况下进行衍生，最终通过反转C18柱进行分离，检测器进行定量。具体操作程序为取出10 g试样，用水将试样溶解并定容至100 mL，然后进行离心处理，将上清液穿过免疫亲和柱，再用1 mL甲醇进行洗脱，将洗脱液提取出来，定容到2 mL，混合后，使用 HPLC对其进行分析。该方法采用色谱柱温度为30 ℃，色谱柱流率为0.8 mL/min，色谱柱的色谱条件为甲醇、水；荧光探测器发射波长为435 nm ，激发波长为365 nm ，进样量为50 mL。

通过对牛奶中黄曲霉毒素M1的测定，其测定值在91.2%～106.4%，测定值最小为0.4 μg/kg。取黄曲霉毒素M1真值为0.085 μg/kg的阳性奶粉标准物质30 g，一式3份平行样，用该方法进行检测和分析，得到0.081 2、0.083 7、0.084 1 μg/kg,根据结果可知，3次检测皆在允许范围内，与真值近似。利用 HPLC法对其进行检测和分析，其具有高效、灵敏、快速、准确、检出限低、特异性强和再现性好等特点。然而，由于样本处理过程复杂（预处理会导致AFM1丢失）、净化柱消耗大、检测成本高，因此需要操作人员具有较高的职业素质[3]。

2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）

其原理为将待测样本中AFM1蛋白与待测样本中被测样本进行特异结合，通过与待测样本特异作用，在待测样本上形成一种新的抗原-抗体复合物。在清洗过量抗体组份之后，添加酶标物 II抗，并且与该抗体发生反应，在酶作用下，使显色剂显色，并且能够根据显色深度来判断样本中含有AFM1的数量。换言之，取50 mL待检牛奶样品，将其冷却10 ℃之下，以3 500 r/min速度进行10 min离心，用吸管吸去表层脂肪层，取下层乳液展开检测。在此基础上，本文提出一种特殊方法，即将AFM1抗体包裹在一种特殊膜上，并在4 ℃下存放一晚，以达到精确AFM1抗体目的。将AFM1标准液和试样处理液分别加入每个小孔，然后加入AFM1酶型粘合剂，37 ℃下30 min进行反应；清洗后，将酶底物和显色剂加入每个孔洞中，在37 ℃下15 min内进行显色，可通过目视方法或仪器方法进行检测。由此绘制在试样中的标准曲线。该检测方法具有特异性强、灵敏、快速、成本低等特点，其仪器的使用非常方便，大大降低了工作人员的劳动量，而且待检样品无需经过特别处理即可对其进行测定。所以，当需要进行大规模检测或现场检测时，皆可使用该方法。

2.3 薄层层析法(TLC)

薄层层析法又称薄层色谱，是一种快速、准确测定样品的方法。1990年，薄层层析法（TLC）被美国分析化学协会（AOAC）确立为标准法。用该方法提取、浓缩、薄层分离，用365 nm紫外光照射AFM1，使其发出蓝紫荧光，并以其在平板上所显示最小荧光探测值，与标准液荧光强度进行比较来测定其强度。具体方法如下：先用三氯甲烷提取黄曲霉毒素M1，再向残留物中加入四氯化碳及氯化钠-甲醇，再用三氯甲烷提取，最终用 TLC进行定量分析。结果显示：奶粉中黄曲霉毒素M1测定的最低限度为0.5 μg/kg，用1∶3硫磺显色可提高测定最低限度为0.3 μg/kg。以空白样品为标样，分别在0.5、2.0、10.0 μg/kg条件下，测定3个条件下的样品，其测定结果在85.6%～98.6%之间，其相对误差为11%，符合试验条件[4]。

2.4 免疫亲和柱法

20世纪90年代，研究人员开发出一种新型、高选择性、高纯度的方法——“免疫亲和柱”。具体操作为：将含盐牛奶与含水牛奶混合制成还原奶，用离心法将牛奶中油脂与AFM1乳清相分离。提取上清液，滤出，将特异性单克隆抗体与AFM1经免疫亲和柱结合。在此基础上，用水冲洗法将AFM1从抗原中分离出来，再用甲醇洗涤。将显色剂添加到甲醇溶液中，用萤光法对其进行测定，其检出最低限值为0.1 μg/kg。

将黄曲霉毒素M1（0 、0.1、0.5、1.0 μg/kg）定容至50 mL，以测定其含量，结果如表1所示。

表1 奶粉添加回收率实验结果表

经上述试验，本发明测定方法对奶制品中AFM1的测定，其测定值为0.1～1 μg/kg，其测定值平均回收率为89.6%～96.0%, CV变异系数为0.52%～5.8%，符合国标测定要求。经测定，该方法检出率为0.1 μg/kg，比国标规定0.5 μg/kg低。

曹叶中等人将该技术应用于牛奶中 AFM测定，其检出率为0.05 μg/L，平均回收率为97%。该新检测技术虽简化了样本预处理流程，不需采用参照物AFM1，减少操作者风险，但整个检测流程较烦琐、时间较长，且易产生大量试剂造成环境污染，进而导致其应用范围有所限制。

3 检测结果分析

上述4种测定法是目前国际上对牛奶和奶制品中AFM1进行测定的主要手段，其具体特征见表2。

表2 检测结果对照表

4 牛奶中黄曲霉毒素的危害分析

黄曲霉毒素是一种致命的真菌毒素，存在于霉变牛奶和乳制品中，不仅会对人体的内脏器官、免疫系统和神经系统造成损伤，还会增加某些癌症发病率。因此，我们必须注意食品安全，避免食用过期或泛黄的牛奶和乳制品，特别是婴幼儿、孕妇和老人等人群，更应选择无毒素和安全的产品。长期摄入含有黄曲霉毒素的牛奶或乳制品可能会导致如下健康问题。①肝脏损伤：黄曲霉毒素会被肝脏代谢，严重的霉菌感染会导致肝脏损伤及肝细胞坏死。②免疫抑制：高剂量的黄曲霉毒素会导致免疫系统的抑制，从而增加感染的可能性。③神经系统问题：黄曲霉毒素可以影响神经系统，包括对中枢神经系统的损伤，脑部发育的影响以及神经信号传递的干扰。④癌症：一些研究显示，长期摄入含有黄曲霉毒素的食物，可能增加某些癌症的发病率，如肝癌和食道癌[5]。

5 结语

本文介绍了奶制品中存在的黄曲霉毒素的类型、危害性、产生原因、检测技术等内容，以及对黄曲霉毒素的检测方法，如高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附法（ELISA）。其中， HPLC法具有高效、灵敏、快速、准确等特点，需要操作人员具有较高的职业素质； ELISA法是一种特殊的检测方法，能够将待测样本中AFM1蛋白与待测样本中被测样本进行特异结合，通过与待测样本特异作用，使显色剂显色，并根据显色深度来判断样本中含有AFM1的数量。总体而言，这些检测方法都具有特异性强、灵敏、快速等特点，能够对奶制品中的黄曲霉毒素进行检测。