乳及乳制品三聚氰胺检测中液相色谱-串联质谱法的运用

◎ 王飞雄

（高培（广州）乳业有限公司，广东 广州 511300）

三聚氰胺也被称之为密胺，相对分子量为126.12，属于三嗪类含氮杂环有机化合物。目前，在化工、医药、食品生产以及涂料等领域中，对于三聚氰胺的使用量相对较高。其中，部分食品企业在乳与乳制品生产过程中，为了提高食品中的蛋白质含量，加入了一定含量的三聚氰胺。三聚氰胺具备一定的毒性，对人体的生命健康安全造成影响。部分生产厂家为了降低成本，在检测三聚氰胺的过程中采取了凯式定氮法，该方法仅能检测物品的含氮量，为此，本研究通过利用液相色谱-串联质谱法，完成乳与乳制品三聚氰胺检测工作，确保乳与乳制品的食用安全[1]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

采用LCMS-8040高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪、MS3Digital漩涡混合器、ME303电子天平、B-400粉碎均质机、CF16RXII高速离心机以及L22-500B超声波清洗机。以液态乳、酸奶作为样品。由德国采购纯度为99.5%的三聚氰胺，乙腈与乙酸为色谱纯，0.22 μm微孔滤膜、纯度达到90%的二氯甲烷、乙酸铵、盐酸。

1.2 标准溶液的配制

①标准储备液。称取0.1 mg三聚氰胺标准品置于100 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液（体积比1∶1）溶解并定容至刻度，制备质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，保存到温度为20 ℃的避光环境中。②三氧乙配溶液（1%）的配制。准确称取三氧乙酸2.5 g（精确至0.1 mg）于250 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀后备用。③标准曲线绘制。采取流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释，配置0.40、0.80、2.00、4.00 μg/mL，进样10 μL，保留时间7.8 min定性，峰面积定量，回归方程Y=1.8×10-4X-0.36（r=0.999）。

1.3 样品前处理

在实验检测前，准确称取0.5 g样品，使用15 mL的具塞塑料离心管吸入10 mL比例为1∶1的乙腈-水溶液，涡旋时间控制在30 s，利用超声提取25 min，使溶液以8 000 r/min离心10 min，提取液转入25 mL比色管后，加入10 mL二氯甲烷，再加入150 μL HCl(1 mol/L)，进行密封处理振荡2 min，取出1 mL上清液，并加入4 mL的乙腈完成稀释，使用0.22 μm滤膜完成过滤[2]。

1.4 色谱分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLCBEHHILIC（2.1×75 mm,1.7 μm）；柱温：0～40 ℃；流速：0.6 mL/min；流动相：由80%乙腈和20%水混合；进样量：2 μL。

1.4.2 质谱条件

ESI正离子检测模式；离子源温度控制在150 ℃；毛细管电压控制为3.5 kV；脱溶剂温度控制在550～600 ℃，萃取电压控制在3～5 V；脱溶剂气为N2、锥孔气为N2；脱溶剂与锥孔气流速分别控制在600 L/h与50 L/h；碰撞气属于高纯氩气，碰撞室压力控制在35 MPa；离子对驻留时间控制在0.16 s。离子监测条件如表1所示。

表1 离子监测条件表

2 结果与分析

2.1 样品前处理的选择

乳与乳制品中包含了大量的蛋白质以及脂肪，在实验中需对样品进行提前处理。降低基质效应，促使实验检测灵敏度得到提高。在研究中使用液液萃取、超声波萃取等方式，结合三聚氰胺可溶于乙腈的特点，而乙腈则具备蛋白质沉淀作用，为此提取液选择以乙腈-水溶液为主，根据GB 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》，乙腈-水比例分别控制为8∶2、7∶3、5∶5。最终实验结果显示，乙腈-水溶液比例控制在5∶5，三聚氰胺提取效率达到最高，乳与乳制品中的蛋白质沉淀效果达到最佳。在超声波提取作业开展中，主要是为了提高三聚氰胺的提取效率。在实验中，超声波提取时间控制在25 min，三聚氰胺提取效率达到最高，超出25 min无法提高三聚氰胺提取效率。乳与乳制品取样时，发现样品中含有3%脂肪含量，通过使用二氯甲烷以液液萃取方式去除脂肪，提取液用乙腈以1∶4倍稀释，避免对实验过程造成干扰[3-4]。

2.2 色谱条件优化

三聚氰胺具备亲水性与强极性特点，在C18色谱柱上难以实现保存。为此，在实验过程中，利用亲水作用色谱柱（HILIC），可保留三聚氰胺，达到分离检测定性量目的。流动相选择时，应考虑流动相对组分的洗脱能力，确保离子化效率得到有效提高。为此，分别选择了0.1%、0.2%的甲酸-水与5 mol/L、10 mol/L醋酸铵、甲醇以及乙腈。发现正离子模式下常用的甲酸-水对出峰影响相对较低，10 mol/L醋酸铵溶液对出峰影响较为显著，乙腈作为流动性有机相优于甲醇，最后维持流动性体系10 mol/L醋酸铵溶液的基础上，选择乙腈-水溶液流动性配比，确定本文研究中1.4的流动性比例与梯度。三聚氰胺标准溶液的离子流色谱如图1所示。

图1 三聚氰胺标准溶液的离子流色谱图

2.3 质谱条件优化

在实验中配置浓度达到500 μg/mL的三聚氰胺标准溶液，以质谱正负离子模式为基础，对样本进行全面扫描。由于正离子模式实验灵敏度相对较高，所以在实验中采取ESI源正离子模式扫描。通过对三聚氰胺分子量126.12扫描后，找出母子离子，使用产物离子模式扫描找出2个子离子峰，对离子与电压进行优化与微调，从而获得m/z67定性子离子与m/z84定量子离子。在实验中确定离子驻留时间以及碰撞电压，明确母子离子电压质谱参数，为三聚氰胺检测创造条件。各项参数如表2所示。

表2 三聚氰胺检测质谱参数表

2.4 标准曲线及方法检测限

在实验检测工作开展中，利用UPLC-MS/MS完成质量浓度0.5～100 μg/L的三聚氰胺标准工作液测定工作，定量离子峰面积为Y，10%标准溶液质量溶度设置为X，获取线性方程组Y=372.0X-57.50，线性关系（r=0.999），在空白基质样品中，逐级加入三聚氰胺标准溶液，在信噪比（S/N）大于10，浓度达到5 μg/kg时，最终方法检出限（LOD，S/N= 3）为0.005 mg/kg，定量限（LOD，S/N=10）为0.001 7 mg/kg。

2.5 方法的精密度和回收率

在乳与乳制品检测工作开展中，以液态乳以及酸奶为样品，根据本文2.1样品前处理的选择完成样品处理作业，利用LC-MS/MS完成分析。在相同条件、同一时间下，每个浓度水平重复测定次数控制在6次以上，每一次检测后计算出回收率与（RSD）相对标准偏差。计算结果如表3所示。根据表3中的各项数据信息，发现样品检测回收率控制在91.0%～97.5%之间，标准偏差小于9.05%，从而证明液相色谱-串联质谱法检测效果较为显著。

表3 回收率与（RSD）相对标准偏差表

3 结语

综上所述，在乳与乳制品三聚氰胺检测工作开展中，通过液相色谱-串联质谱法的有效运用，以乙腈-水溶液（5∶5）作为提取液，通过液液萃取完成乳与乳制品蛋白质以及脂肪提取，利用稀释完成样品实验。在液相色谱-串联质谱法使用的过程中，整体操作较为简易，减少了各种试剂以及材料的使用，增强了三聚氰胺检测定性与定量的准确度，满足三聚氰胺检测标准要求[5]。