miR-141-3p靶向CDC25B调节VEGF通路对三阴性乳腺癌血管生成的机制研究

陈燕枝

(江西医学高等专科学校病理学与病理生理学教研室, 江西 上饶 333400)

三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)是一种不表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)的特定乳腺癌亚型,由于具有高异质性,侵袭性并缺乏治疗选择,TNBC患者的生存时间更短,5年生存率比雌激素受体阳性乳腺癌低8～16%,且预后较差[1]。因此,需要寻找新的分子靶点进行干预治疗TNBC。近年来,研究发现肿瘤血管生成在肿瘤发生、发展中发挥重要作用,肿瘤的生长和转移在很大程度上依赖于血管生成[2]。肿瘤血管生成是指从现有的血管系统中形成新血管,而这一过程可为增殖和转移的癌细胞提供必要的营养和氧气。血管生成抑制剂已成为许多实体瘤的有效治疗策略,如抗血管形成药物bevacizumab已被证实对TNBC治疗有效[3]。因此,深入探讨TNBC血管生成的分子机制对TNBC的治疗具有重要意义。细胞分裂周期25B(cell division cyclin25 B,CDC25B)在许多原发性肿瘤中过度表达,包括乳腺癌[4]、结直肠癌[5]和食管鳞状细胞癌[6]等。如在子宫内膜癌中,miR-152通过抑制CDC25B的表达,诱导G2/M期阻滞,从而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。目前关于CDC25B影响TNBC血管生成的研究尚未有报道,因此,本研究将进一步探究CDC25B对TNBC血管生成的影响及其作用机制。本研究发现CDC25B在TNBC中显著上调表达并参与调控VEGF通路,沉默CDC25B能够抑制TNBC血管生成。此外,miR-141-3p靶向负调节CDC25B的表达,进而抑制VEGF通路抑制TNBC血管生成。本文阐明了miR-141-3p/CDC25B/VEGF轴在TNBC血管生成过程中的调控作用及分子机制,为靶向TNBC血管生成提供了潜在的分子靶点。

1 资料与方法

1.1生信分析:从TCGA中下载乳腺癌mRNA表达量数据(Normal:41,Tumor:473),利用'edgeR'包对mRNA进行normal组和tumor组的差异分析(|logFC|>1.5,FDR<0.05)获得DEmRNA,通过文献引证确定研究的目标基因CDC25B。利用starbase数据库预测乳腺癌中目标基因上游的调控miRNA,通过Pearson相关性确定研究对象为miR-141-3p。利用GSEA软件对CDC25B基因进行通路富集分析。

1.2细胞培养:从ATCC(美国)购入293T、人乳腺上皮细胞MCF-10A、人TNBC细胞系(BT-549、MDA-MB-468、MDA-MB-231)和人脐静脉内皮细胞HUVEC。上述所有细胞系均在含10% FBS的RPMI-1640培养基中培养,培养环境为37℃,含5%CO2。

1.3细胞转染:miR-mimic(miR-141-3p mimic)si-CDC25B、oe-CDC25B及其阴性对照mimic-NC、si-NC和oe-NC均购自Ribobio(China)。根据制造商的说明,使用Lipofectamine2000(Invitrogen,USA)将上述载体转染到TNBC细胞中。

1.4细胞增殖检测:用Cell Counting Kit-8(CCK-8)进行细胞增殖试验。将细胞以4×103个细胞的密度接种于96孔培养板中培养24h。分别在0d、1d、2d、3d和4d后,将CCK-8溶液添加到细胞中,并在450nm处对每个孔中细胞的吸光度进行测定。

1.5HUVEC血管形成试验:将50μL未稀释的基质凝胶(Corning,USA)加入96孔板中培养30min。然后,将1×104个HUVEC细胞添加到Matrigel预涂层的96孔板中,并与来自转染成功的TNBC细胞的条件培养基(CM)孵育。6h后对小管进行观察并拍照。

1.6qRT-PCR:通过TRIZOL试剂(Invitrogen,USA)从细胞系中提取总RNA,用MultiScribeReverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific,USA)进行cDNA合成,并使用SYBR Green Real-Time PCR assay kit (Thermo Fisher Scientific,USA)进行扩增和检测,qRT-PCR在ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems,USA)上进行。U6和β-actin分别作为miR-141-3p和CDC25B的内参基因,通过2-ΔΔCT计算目的基因的相对表达水平,引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7Western blot实验:从TNBC细胞中提取的总蛋白样品在SDS-PAGE中进行电泳分离,随后电转移到PVDF膜上。然后用5%脱脂牛奶封闭细胞1h,并用一抗在4℃孵育过夜,然后用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育2h。通过ECL试剂盒(Pierce Biotechnology,USA)检测蛋白条带,并在化学发光成像系统上成像。本文所用的一抗包括:兔抗β-actin,兔抗CDC25B,兔抗VEGFA,兔抗VEGFR-2和兔抗VEGFR-3。

1.8双荧光素酶报告分析实验:构建了包含miR-141-3p结合位点的CDC25B野生型(WT)或突变型(MUT)双萤光素酶报告质粒。将上述质粒与miR-mimic和mimic-NC共转染到293T细胞中。培养48h后,用双荧光素酶报告系统(Promega,USA)测定荧光素酶的活性。

1.9数据分析:统计分析使用GraphPad Prism 8.0版本进行。所有数据均表示为平均值±标准差。组间差异的P值由两组比较的Student's t检验或多组比较的单因素方差分析确定。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1CDC25B在TNBC中上调表达:首先,基于TCGA数据库发现CDC25B在TNBC肿瘤组织中显著上调(图1A)。随后,通过qRT-PCR检测了TNBC细胞系(BT-549、MDA-MB-468、MDA-MB-231)中CDC25B的表达水平,发现CDC25B在TNBC细胞系中的表达水平相较于人正常乳腺癌上皮细胞系(MCF-10A)显著升高(图1B-C)。进一步通过GSEA分析发现CDC25B显著调控VEGF SIGNALING PATHWAY通路(图1D)。

图1 CDC25B在TNBC中上调表达

2.2CDC25B通过调控VEGF通路促进TNBC血管生成:为了阐明CDC25B在TNBC血管生成中的潜在作用,将si-NC/si-CDC25B和oe-NC/oe-CDC25B分别转染到MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞进行后续实验。本研究发现,相较于si-NC组,si-CDC25B组细胞中的CDC25B的表达显著降低(图2A,E),而相较于oe-NC组,oe-CDC25B组细胞中的CDC25B的表达显著升高。CCK-8检测结果显示,与对照组相比,si-CDC25B组细胞的增殖水平明显下降,而oe-CDC25B组细胞的增殖水平明显上升(图2B)。为了确定CDC25B是否参与TNBC血管生成,我们将HUVEC细胞与转染si-NC/si-CDC25B和oe-NC/oe-CDC25B的TNBC细胞条件培养基共孵育。血管形成实验结果表明,CDC25B的沉默表达显著抑制了HUVEC细胞的血管形成,而过表达CDC25B则明显促进了HUVEC细胞的血管形成(图2C-D)。与此同时,沉默CDC25B明显抑制了血管生成因子VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表达,而过表达CDC25B得到相反的结果(图2E)。上述研究结果表明CDC25B可以在TNBC进展过程中促进HUVEC细胞的血管生成。

图2 CDC25B通过调控VEGF通路促进TNBC血管生成

2.3miR-141-3p靶向下调CDC25B的表达:为了探索CDC25B在TNBC中促血管生成功能的分子机制,我们利用starbase数据库寻找CDC25B的上游潜在调控miRNA,与差异上调基因取交集共得到3个差异的miRNA(图3A)。利用Pearson相关性分析发现CDC25B与miR-141-3p的显著负相关(图3B),且miR-141-3p在TNBC肿瘤组织中下调表达(图3C)。此外,生信数据库预测到miR-141-3p与CDC25B存在潜在的结合位点(图3D)。为进一步验证生信的结果,qRT-PCR分析结果显示miR-141-3p在TNBC细胞中下调表达(图3E)。随后,双荧光素酶报告分析发现,miR-mimic可以降低293T细胞中野生型CDC25B的荧光素酶活性,(图3F)。此外,过表达miR-141-3p后CDC25B的mRNA和蛋白表达显著下调(图3G-H)。上述结果表明,miR-141-3p靶向下调CDC25B的表达。

图3 miR-141-3p靶向下调CDC25B的表达

2.4miR-141-3p通过靶向CDC25B调节VEGF通路抑制TNBC血管生成:为了阐明miR-141-3p/CDC25B在TNBC血管生成中的作用,我们设置了回复实验,将mimic-NC+oe-NC、miR-mimic+oe-NC和 miR-mimic+oe-CDC25B转染到MDA-MB-231细胞中。我们发现,与mimic-NC+oe-NC组相比,miR-mimic+oe-NC组细胞中CDC25B的表达显著下调,而miR-mimic+oe-CDC25B组细胞中CDC25B的表达得到部分回复(图4A,E)。CCK-8分析结果显示,过表达miR-141-3p显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力,而进一步过表达CDC25B逆转了miR-141-3p对细胞增殖的抑制作用(图4B)。血管形成实验结果表明,miR-141-3p过表达显著抑制了HUVEC细胞的管形成能力,而进一步过表达CDC25B逆转了这一结果(图4C-D)。Western blot结果显示,miR-141-3p过表达显著下调了VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表达,而TmiR-141-3p过表达的同时过表达CDC25B使这些蛋白的表达回复到对照组水平(图4E)。这些结果表明,miR-141-3p通过靶向CDC25B抑制VEGF通路活性,进而抑制TNBC血管生成。

图4 miR-141-3p通过靶向CDC25B调节VEGF通路抑制TNBC血管生成

3 讨 论

研究表明,肿瘤的生长和转移在很大程度上依赖于血管生成。肿瘤血管生成是指从现有的血管系统中形成新血管,而这一过程可为增殖和转移的癌细胞提供必要的营养和氧气。近年来,肿瘤血管生成过程的研究越来越受到人们的关注,血管生成抑制剂已成为许多实体瘤的有效治疗策略[7]。抗血管生成药物主要是通过阻断血管内皮生长因子(VEGF)/VEGF受体(VEGFR)信号通路实现破坏血管供应并使肿瘤缺乏营养和氧气[8]。截至目前,FDA已批准上市多种靶向血管生成信号通路的药物,并在临床抗肿瘤治疗中显示出良好的益处[9]。考虑到血管生成对TNBC的发生、进展和预后至关重要,探究参与调节TNBC血管生成的分子机制有助于为开发新型有效的抗血管生成策略提供支持。本研究的结果表明CDC25B在TNBC中具有显著的促血管生成作用,CDC25B可能是TNBC治疗的潜在治疗靶点。

CDC25B是G2/M细胞周期进展的关键参与者。最近,CDC25B在肿瘤进展中致癌特性被诸多报道。如在头颈部鳞状细胞癌中,METTL3增强CDC25B的m6A修饰,促进头颈部鳞状细胞癌恶性进展[10]。在TNBC中,microRNA-211靶向负调节CDC25B表达抑制TNBC细胞的生长和迁移[11]。本研究同样也发现CDC25B在TNBC中显著高表达,过表达CDC25B可以促进TNBC细胞的增殖。此外,据报道METTL3增强了CDC25B mRNA的m6A修饰,从而保持其稳定性并上调其表达,从而激活细胞周期的G2/M期并促进头颈部鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成[11]。本研究中,CDC25B高表达富集在VEGF通路上。沉默CDC25B可以降低VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表达,进而抑制TNBC中内皮细胞的血管生成能力。在肿瘤中,VEGF与在内皮细胞上表达的VEGFR结合,从而积极调节血管生成过程[12]。因此,目前靶向VEGF信号通路的疗法被认为在阻断癌症血管生成中是极其重要的。这些结果表明CDC25B是调节VEGF通路的关键介质,提示其可能是阻断肿瘤血管生成的潜在治疗靶点。

为进一步明确CDC25B在TMBC血管生成中的分子作用机制。通过生信分析发现CDC25B存在上游调控分子miR-141-3p,miR-141-3p可以靶向抑制CDC2B的表达。miR-141-3p已被报道与多种癌症的恶性进展有关,在乳腺癌和乳头状甲状腺癌中作为抑癌基因发挥作用。一项研究报道,miR-141-3p通过靶向TRAF5抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究中,miR-141-3p在TNBC中低表达,过表达miR-141-3p可以抑制TNBC细胞增殖,这与Li W等的研究结果一致。除此之外,本研究还发现miR-141-3p可以靶向CDC25B抑制VEGF通路的活性和降低VEGFA、VEGFR2和VEGFR-3的表达,进而抑制TNBC血管生成。总之,这项研究首次揭示了miR-141-3p/CDC25B轴在TNBC血管血管生成中功能及其调控机制,为TNBC抗血管生成疗法提供了潜在的靶点。

综上所述,本研究证实CDC25B在TNBC中显著高表达,且通过介导VEGF信号通路参与调节TNBC血管生成。从机制上讲,CDC25B受到上游调控分子miR-141-3p的调控,miR-141-3p靶向抑制CDC25B的表达并通过抑制VEGF途径抑制TNBC血管生成。尽管本研究通过体外实验揭示了miR-141-3p/CDC25B/VEGF通路抑制TNBC血管生成的机制,但仍存在不足之处,未来尚需进一步通过开展动物实验和临床试验在体内验证本研究结果的准确性。此外,该通路是否参与调控TNBC其他恶性过程有待进一步探究。总之,本研究结果表明miR-141-3p/CDC25B/VEGF通路是抑制TNBC血管生成的关键调控机制,这可能为TNBC抗血管生成治疗提供新途径。