缺氧环境下HIF-1调控PAD4介导的H3cit促进子宫内膜腺上皮细胞凋亡

黄 勇, 罗 书, 廖 源, 王开举

(海南医学院第二附属医院, 海南 海口 570311)

子宫内膜是女性生殖系统中至关重要的组织,其周期性重塑和变化对于妊娠的建立至关重要。这一过程涉及多种激素和转录因子的调控,其中子宫内膜腺上皮细胞凋亡在调节子宫内膜结构和功能中起着重要作用[1,2]。但其凋亡的具体形成机制还有待研究。缺氧是许多生理和疾病状态的共同特征,特别是在妊娠障碍疾病中,缺氧信号发挥关键作用[3,4]。在缺氧条件下,缺氧诱导因子1(HIF-1)被激活,从而调控多种基因表达发挥生理性,包括肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)[5]。PAD4可以介导蛋白质的精氨酸残基转化为瓜氨酸残基,其产物瓜氨酸化组蛋白H3(H3cit)在凋亡和炎症反应中发挥重要作用[6]。研究表明,女性PAD4和H3cit的水平增加会引起子宫的损伤和衰竭[7]。然而在子宫内膜腺上皮细胞中,缺氧条件是否可以通过HIF-1调控PAD4基因进而引发凋亡仍不清楚,其相关的机制仍有待进一步研究。在本实验中,通过构建过表达HIF-1以及沉默PAD4的细胞系,检测其对子宫内膜腺上皮细胞凋亡的影响,并探讨相关机制,为子宫内膜类疾病的发生及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料:宫内膜腺上皮细胞CM-H058(货号:CM-H058)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;胎牛血清(货号:CMS101.03)购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司;qPCR SYBR Green Master Mix(货号:Q111-02)购自南京诺唯赞医疗科技有限公司;HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因引物由上海生工生物工程公司合成;HIF-1(货号:ab1)、H3cit(货号:ab5103)、Caspase3(货号:ab32351)、Caspase7(货号:ab255818)抗体购自abcam公司;PAD4(货号:17373-1-AP)抗体购自武汉三鹰公司;细胞凋亡检测试剂盒(货号:E-CK-A211)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;MinElute PCR纯化试剂盒(货号:57704)购自德国Qiagen;oe-PAD4、oe-NC以及sh-NC、sh-HIF-1慢病毒质粒湖南丰晖生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养:宫内膜腺上皮细胞CM-H058培养于RIPM 1640培养基中,培养基中添加10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)。当细胞密度生长至80%时进行细胞传代,并适时更换新鲜培养基以供细胞生长需要,将细胞培养在37℃,含5%CO2的湿化培养箱中。

1.2.2慢病毒转染法构建过表达HIF-1/沉默PAD4的细胞系:将细胞以2×105的密度接种在六孔培养皿中,等待细胞生长密度到达70%时转染病毒。分别设置oe-NC组(转染oe-NC)、oe-PAD4组(转染oe-PAD4)、oe-PAD4+sh-NC组(转染oe-PAD4与sh-NC)、oe-PAD4+sh-HIF-1组(转染oe-PAD4与sh-HIF-1)。每孔所需病毒量[病毒体积=(MOI×细胞数量)/病毒滴度,病毒滴度=2×108TU/mL],病毒感染约72h后,将培养基更换为含有4μg/mL嘌呤霉素的选择培养基。分离嘌呤霉素抗性细胞克隆,在含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基中扩增7d,然后转移到不含嘌呤霉素的培养基中。

1.2.3qRT-PCR检测HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表达水平:TRizol试剂提取细胞中的总RNA,使用酶标仪检测RNA纯度和浓度。依据strand cDNA Synthesis试剂盒操作说明进行逆转录实验。按照qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒指示配制qRT-PCR反应体系。以GAPDH为引物,按照2-ΔΔCt公式计算基因相对表达量。引物序列如下:HIF-1,正向:CCCCGAGTTGCAGTATCAAAT,反向:AACGGACAAACGGACACACA;PAD4,正向:AAACGCGTGATGGGCTTCC,反向:AAGAAAGCAAGCCACTGCTG;Caspase3,正向:GAGCTTGGAACGGTACGCTA,反向:CCGTACCAGAGCGAGATGAC;Caspase7,正向:CCGTGGGAACGATGACCG,反向:GATTCATCAACGAACGGCGG;GAPDH,正向:AATGGGCAGCCGTTAGGAAA;反向:GCGCCCAATACGACCAAATC。

1.2.4Western blot HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7的蛋白表达水平:用RIPA裂解缓冲液提取细胞中的总蛋白,并使用BCA测定蛋白浓度。通过12% SDS-PAGE电泳分离蛋白质(120V,90min)并转移至PVDF膜(300mA,60min)。随后,将PVDF膜用5%脱脂牛奶室温封闭60min,并与一抗(均按1∶1,000稀释)在4℃下孵育过夜。然后将膜与抗兔二抗(1∶5000稀释)在室温下孵育2h。使用ECL试剂盒检测蛋白质条带,并使用生物放射成像系统量化每种蛋白质的相对表达。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡水平:用预冷的磷酸盐缓冲盐水PBS洗涤细胞两次,并根据制造商的说明进行细胞凋亡测定。简而言之,每管加入100μL 1×结合缓冲液,充分悬浮细胞。加入染料并将细胞在室温下避光孵育15min,然后加入300μL 1×结合缓冲液悬浮细胞。然后将细胞悬液转移至避光的5mL流式细胞仪管中,并在1h内进行流式细胞术。

1.2.6ChIP-qPCR检测PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7转录起始位点(TSS)富集水平:CM-H058细胞在15cm平板中生长至85%汇合度。细胞在1%甲醛中固定8min。通过超声处理对染色质进行剪切,4℃12000r/min离心10min。每个ChIP10μg HIF-1抗体,孵育过夜,离心后去上清,加入洗脱缓冲液,室温孵育10min,离心后收集上清,65℃ 6h。通过MinElute PCR纯化试剂盒纯化DNA。参考1.2.3进行qRT-PCR检测。TSS引物序列:Caspase3,正向:GTCATCTCGCTCTGGTACGG,反向:CACACACACAAAGCTGCTCC、Caspase7,正向:ACTTCGACAAAGCGACAGGT,反向:GTCACGCCATCTTTCCCGTA。

2 结 果

2.1缺氧环境下HIF-1、PAD4、H3cit以及细胞凋亡水平升高:qRT-PCR结果显示,与常氧组比较,缺氧组HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表达升高(P<0.05),见表1。Western blot结果显示,与常氧组比较,缺氧组HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表达升高(P<0.05),见图1和表2。流式细胞术结果显示,与常氧组比较,缺氧组细胞凋亡水平升高(P<0.05),见表3。

表1 两组细胞中HIF-1 PAD4 Caspase3 Caspase7基因表达比较

表2 两组细胞中HIF-1 PAD4 H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表达比较

表3 常氧组和缺氧组细胞凋亡率比较

图1 两组细胞HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表达曝光图

2.2敲低HIF-1抑制PAD4、H3cit以及细胞凋亡水平:qRT-PCR结果显示,与sh-NC组比较,sh-HIF-1组HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表达降低(P<0.05),见表4。Western blot结果显示,与sh-NC组比较,sh-HIF-1组HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表达降低(P<0.05),见图2和表5。流式细胞术结果显示,与sh-NC组比较,sh-HIF-1组细胞凋亡水平降低(P<0.05),见表6。

表4 敲低HIF-1对PAD4 Caspase3 Caspase7基因表达的影响

表5 敲低HIF-1对PAD4 H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表达的影响

表6 敲低HIF-1对细胞凋亡的影响

图2 敲低HIF-1后细胞HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表达曝光图

2.3过表达PAD4拮抗HIF-1对细胞凋亡的影响:qRT-PCR结果显示,与sh-HIF-1+oe-NC组比较,sh-HIF-1+oe-PAD4组PAD4、Caspase3、Caspase7基因表达升高(P<0.05),见表7。Western blot结果显示,与sh-HIF-1+oe-NC组比较,sh-HIF-1+oe-PAD4组PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表达升高(P<0.05),见图3和表8。流式细胞术结果显示,与sh-HIF-1+oe-NC组比较,sh-HIF-1+oe-PAD4组细胞凋亡水平升高(P<0.05),见表9。

表7 过表达PAD4对Caspase3 Caspase7基因表达的影响

表8 过表达PAD4对H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表达的影响

表9 过表达PAD4对细胞凋亡的影响

图3 过表达PAD4后细胞H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表达曝光图

2.4过表达PAD4促进Caspase3、Caspase7基因转录:ChIP-qPCR结果,与sh-HIF-1+oe-NC组比较,sh-HIF-1+oe-PAD4组PAD4、H3cit和H3K27ac在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平增加(P<0.05),见表10。

表10 两组细胞PAD4和H3cit在Caspase3 Caspase7 TSS富集比较(/input %)

3 讨 论

恒定的氧气供应对于正常的组织功能、发育和体内平衡至关重要,在缺氧微环境下,细胞的代谢将会重编程,激活不同的分子信号通路以适应缺氧环境,包括血管生成、葡萄糖代谢和细胞增殖等生理过程。当氧水平下降时,细胞会通过一系列基因和蛋白表达的调控从而引发细胞凋亡[8]。细胞凋亡可以清除功能失调的细胞,在维持正常组织的生理功能中起着至关重要的作用,但是异常或过度的细胞凋亡将会导致组织损伤[9]。子宫内膜腺上皮细胞的过度凋亡将导致子宫内膜损伤,炎症细胞以及炎性因子浸润,进而进一步破坏子宫内膜屏障功能[10]。因此探究缺氧条件下子宫内膜腺上皮细胞的凋亡分子机制对缓解子宫内膜损伤有治疗意义。

HIF-1是一种异二聚体转录因子,它可以协调机体的适应性反应,以维持氧稳态和适应低氧水平[11]。HIF-1参与胚胎发育、肿瘤生长、转移和缺氧诱导的细胞凋亡等过程[12]。既往研究表明,缺氧条件下,HIF-1表达上调,可通过两种机制诱导细胞凋亡[13]。在本实验中,在缺氧环境下,HIF-1表达水平以及细胞凋亡相关蛋白(Caspase3、Caspase7)表达水平均显著增加,而敲低HIF-1可以降低细胞的凋亡水平,说明缺氧可以诱导子宫内膜腺上皮细胞凋亡,并与HIF-1的表达上调有关。近期研究表明,H3cit表现出高细胞毒性,可能引起组织损伤,导致多器官衰竭[14]。在本实验中,在缺氧环境下,PAD4、H3cit的表达均上调,同时过表达PAD4可逆转敲低HIF-1对细胞凋亡的促进作用,说明PAD4及其介导的H3cit可能位于HIF-1的下游,并参与了缺氧诱导的细胞凋亡。H3cit形成后,组蛋白与DNA的静电结合能力减弱,促进RNA聚合酶Ⅱ能够进入DNA并将其转录成mRNA[3]。为进一步探索PAD4介导H3cit如何诱导细胞凋亡。本实验通过ChIP-qPCR实验检测了PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平,发现过表达PAD4促进PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平。提示PAD4介导的H3cit可以促进Caspase3、Caspase7基因转录,最终诱导子宫内膜腺上皮细胞凋亡。

综上所述,本研究发现缺氧环境下HIF-1与PAD4表达水平增加,HIF-1可以促进PAD4表达。PAD4的表达上调后介导H3cit,进一步诱导凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase7的基因转录,导致宫内膜腺上皮细胞凋亡。以上结果初步明确了缺氧环境下HIF-1与PAD4介导H3cit形成在子宫内膜腺上皮细胞凋亡中的作用,可为进一步探索子宫内膜相关疾病的治疗提供思路。