秦皮乙素对大鼠心肌组织抗氧化能力的影响

于晓磊, 郭 研, 董 怡, 李文鑫, 李 潇

(承德医学院附属医院, 河北 承德 067000)

多柔比星(doxorubicin,DOX)为蒽环类代表药物,但存在心脏毒性,而限制了其应用,可能机制为药物刺激使心肌细胞发生氧化应激损伤,导致细胞内抗氧化和促氧化的平衡失调[1],我们可以通过增强细胞抗氧化能力来减轻心脏毒性。在临床实践中应用辅酶Q10、维生素C、E等药物预防多柔比星所致心脏损伤,但效果欠佳;因此寻找一个方便有效的药物对抗其心脏毒性具有临床意义。秦皮乙素(esculetin,ESC)又称七叶亭,是秦皮的主要有效成分,具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用[2],但是否可以减轻药物所致心肌损伤鲜有报道。在本研究中我们用ESC干预DOX致大鼠心肌损伤,以探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1动物及材料:雄性SD大鼠(体重220～250g)40只购自北京康泰合元生物公司(许可证号:SCXK京2012-0001);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗、兔源P53、鼠双微体基因2(MDM2)、血红素加氧合酶1(HO-1)、核因子E-2相关因子2(Nrf2)、β肌动蛋白(β-actin)一抗均购于Proteintech公司(中国武汉);BCA蛋白浓度测定试剂盒、血清丙二醛(MDA)及氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、多柔比星、秦皮乙素(纯度99%)购于康泰合元生物公司(中国北京)。

1.2动物分组及模型制备:40只雄性SD大鼠随机分为4组,每组10只,分别为:对照组、DOX组、ESC低剂量+DOX组、ESC高剂量+DOX组。模型制备方法[3]:注射用水5mL溶解DOX加入0.9%生理盐水,配置成1mL生理盐水含有DOX0.8mg,避光低温存放备用。DOX组、ESC低剂量+DOX组,ESC高剂量+DOX组从实验第2天开始以2.5mg/kg腹腔注射DOX,隔天1次,共6次;对照组同时腹腔注射等剂量生理盐水。给药方法及处理:对照组和DOX组从实验第1～16天每日4mL生理盐水灌胃;ESC(低剂量&高剂量)+DOX组从实验第1天起以(50mg/kg&100mg/kg)的ESC溶于4mL生理盐水中灌胃,连续16d。末次灌胃后10d,测血中LDH、CK、CK-MB水平;解剖取心脏,处理后浸石蜡、包埋、Masson染色,比较各组心肌组织中胶原纤维的量的变化。DOX组大鼠心脏染色切片显微镜下可见细胞空泡变性,胶原纤维增多,提示造模成功。

1.3大鼠心肌组织SOD和MDA含量测定:取200mg心肌组织,在含有50mmoL/L Tris-HCl (pH 7.4),150 mmoL/L NaCl,5mmoL/L EDTA,1mmoL/L二硫苏糖醇,1%Triton X-100和1% 蛋白酶抑制剂的裂解液中进行匀浆。取匀浆上清液,TBA法测定MDA含量,WST-1法测定SOD活性。

1.4蛋白免疫印迹法检测大鼠心肌组织相关蛋白的表达:使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度,取50μg蛋白样品,上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶,恒定电泳,然后转膜至硝酸纤维素膜上,分别加入P53、MDM2、HO-1、Nrf2、β-actin一抗(用稀释液将一抗按照1∶500稀释)4℃孵育过夜,再分别加入二抗(用稀释液将二抗按照1∶500稀释)室温下1h后ECL化学发光法显色。

1.5统计分析:使用SPSS26.0统计软件进行统计分析,所有实验数据均以均数±标准差表示,对照组和DOX组的比较采用独立样本t检验,ESC低、高剂量+DOX组与DOX组的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1ESC对DOX诱导后大鼠心功能的影响:DOX组与对照组比较,LDH(t=-18.980,P<0.001)、CK(t=-10.954,P<0.001)、CK-MB(t=-15.749,P<0.001)均上升;而ESC低、高剂量+DOX组心肌酶与DOX组相比各项指标均明显下降,说明ESC能减轻DOX对心肌组织的损伤,见表1。

表1 各组大鼠心肌酶变化情况

2.2ESC对DOX诱导后大鼠心肌组织结构的影响:Masson染色后肌纤维成红色,胶原纤维呈蓝色。对照组心肌纤维呈红色,有序排列呈条索状,蓝色胶原纤维含量极少(见图1A)。DOX组小鼠细胞空泡变性,大量的胶原纤维被染成蓝色,相互连接成网状,排列紊乱,分布不均(见图1B);与DOX组比较,ESC低剂量+DOX组蓝色胶原纤维略减少(见图1C);ESC高剂量+DOX组蓝色胶原纤维明显减少(见图1D)。

图1 Masson染色(×200)镜下观察各组大鼠心肌组织中胶原纤维变化

2.3ESC对DOX诱导后心肌组织SOD、MDA活性影响:DOX组大鼠心肌组织MDA与对照组相比升高(t=-18.743,P<0.001),但SOD表达比对照组降低(t=12.517,P<0.001);与DOX组相比,ESC低、高剂量+DOX组大鼠心肌组织MDA表达降低,SOD表达升高,差异均有统计学意义。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织SOD MDA表达量

2.4Western blot 法检测各组相关蛋白的表达水平:DOX组大鼠心肌组织P53表达高于对照组(t=-30.670,P<0.001),但MDM2(t=14.915,P<0.001)、HO-1(t=17.671,P<0.001)、Nrf2(t=20.128,P<0.001)表达明显低于对照组;ESC低、高剂量+DOX组大鼠心肌组织P53表达明显低于DOX组,MDM2、HO-1、Nrf2表达明显高于DOX组。见图2、表3。

图2 大鼠心肌组织中P53、MDM2、HO-1、Nrf2蛋白表达情况

表3 各组大鼠心肌组织中P53 MDM2 HO-1 Nrf2相对表达量

3 讨 论

《伤寒论》中记载的“正在心下,按之则痛”,“心中结痛”,“心下满微痛”,“心下必痛”,“短气但坐”,“胸闷烦惊,谵语”,“心中惕惕大动”等证候,与多柔比星致心肌损伤过程中出现的心绞痛、心律失常、心力衰竭等各阶段的临床表现极为相似。而多柔比星(DOX)在恶性肿瘤化疗中起到重要作用,治疗效果显著,但因其心脏毒性制约了临床上的应用,其主要机制为活性氧生成增加、线粒体功能紊乱、DNA损伤、细胞凋亡等[4]。ESC又称6,7-二羟基香豆素,是香豆素的衍生物,近年研究发现,ESC对胃癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌等癌细胞具有抑制增殖、迁移,诱导凋亡的作用[5]。目前,关于ESC对蒽环类药物所致心肌损伤保护作用的研究鲜有报道,本研究从多方面证实ESC在一定程度上可减少DOX所致心肌组织氧化应激反应,从而保护心肌组织。目前乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)较为特异性地反映心肌细胞的损伤。胶原与机体功能密切相关,而胶原纤维过度堆积、比例失调,是心肌重塑的重要病理特征和形成因素。在本研究中发现DOX可导致大鼠LDH、CK和CK-MB水平升高、心肌组织中胶原纤维增多,但经过ESC处理后心肌酶水平明显降低、心肌组织中胶原纤维减少,从宏观上证实ESC具有保护心肌作用。

氧化应激是导致心肌损伤的重要因素,MDA可直接反映机体内脂质过氧化的强度及速率[6]。SOD是体内重要活性成分,其水平降低意味着机体抗氧化损伤的能力减弱,本研究发现,DOX诱导后大鼠心肌组织MDA异常升高,SOD降低,提示心肌组织抗氧化能力下降、受到自由基损伤;而ESC预处理后逆转了心肌组织中MDA、SOD水平,提示ESC在一定程度上提高了机体抗氧化能力。

鼠双微体基因2(murine double minute2,mdm2 )可与p53形成负反馈环路。正常细胞内的mdm2/p53比值相对保持稳定,损伤后可使mdm2表达显著下降,从而阻断p53介导的多种信号通路活化,最终导致机体发生氧化应激、炎症等多种病理损伤,本实验中证实DOX可导致心肌组织内p53和mdm2平衡,促进p53的堆积,引起心肌组织发生过氧化反应,而针对负反馈环路,本研究也同样发现ESC可通过增加mdm2的表达、抑制p53活性,保护心肌组织。核因子E-2相关因子2(Nrf2)是体内起到抗氧化作用的关键因子[7],它能调节多种抗氧化剂的表达[8]。血红素加氧合酶1(HO-1)通过促氧化剂降解,从而发挥抗氧化等作用。有研究证实,HO-1的表达上调可减轻氧化应激所致的细胞损伤[9],因此Nrf2/HO-1与细胞抗氧化能力密切相关。本实验中我们发现ESC预处理后上调了Nrf2及HO-1的表达,这证实ESC通过增加Nrf2核易位及HO-1的表达来介导抗氧化应激作用。

综上所述,ESC预处理可通过激活p53负反馈通路及Nrf2/HO-1信号途径抑制氧化应激并减少细胞凋亡,从而有效改善心肌功能,然而这仅仅是众多机制中的一个环节,为针对多因素综合干预的药物或方法的研究提供一定的理论基础。