超声造影联合血清CA125 VEGF miR-125a miR-200a对早期诊断子宫内膜癌的诊断价值观察

孙宏伟, 李丽娟, 龚 雪

(1.河北省承德市第三医院, 河北 承德 067000 2.承德医学院附属医院, 河北 承德 067000)

子宫内膜癌(Endometrial carcinoma,EC)主要表现为阴道不规则出血、排液症状,在晚期可出现恶病质表现,虽然现代医疗技术的发展使得子宫内膜癌的预后有一定的改善,但其发病率依然处于增长趋势,及早诊治是提高患者预后的关键[1]。目前临床诊断EC的方式有细胞学检查、刮诊、阴道超声及血清肿瘤标志物,其中刮诊能够通过病理学确诊病理类型,但由于其属于有创性操作,受检者往往存在抗拒心理而推迟检查,耽误诊治时机[2];随着影像学技术的发展,经阴道超声造影(transvaginal sonography contrast-enhanced ultrasonography,TVS-CEUS)技术凭借其安全性高及动态观察病灶等优势在临床得到了广泛应用[3]。糖类抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VAGF)等血清肿瘤标志物对EC的早期诊断有一定的临床价值,但其效能均不够理想,而血清微小RNA(micro-RNA,miRNA)作为一种新的生物标记,尽管迄今为止尚未将其包括在临床应用规范中,但一些临床研究指出,miRNA为疾病的早期临床监测和确定治疗方案提供了方向[4]。基于此本次研究旨在探究超声造影联合血清肿瘤标记物早期诊断EC的临床价值,以期为临床诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取我院2021年10月至2022年2月诊治的120例早期EC患者为研究对象。纳入标准:①符合EC相关诊断标准,且经诊断性刮宫后病理诊确诊为早期EC;②无放、化疗病史或对造影剂过敏;③于本院完成TVS-CEUS检查;④无手术禁忌证。排除标准:①宫腔手术史;②其他部位恶性肿瘤或严重内分泌疾病;③影像学资料异常。另选取同期120例接受手术切除的子宫肌瘤患者为对照组,入组患者均经术后病理诊断。EC组患者中年龄38～79岁,平均(56.15±9.67)岁,绝经前18例,围绝经39例,绝经后63例,术后病理:内膜样癌106例,浆液性癌14例。对照组患者中年龄36～78岁,平均(57.39±10.24)岁,绝经前20例,围绝经35例,绝经后65例。两组患者年龄及绝经状态比较具有可比性(P>0.05)。

1.2方 法

1.2.1TVS-CEUS:取膀胱截石位,使用GE公司LOGIQ E8彩色多普勒成像仪和RIC 5-9-D阴道探头,频率 5 ～ 9MHz行常规彩超检查,完成后将仪器调到超声造影模式,经肘部静脉团注射2.0mL的Sonovue(意大利Brocca),持续性观察180s,记录好病灶组织的显影过程,并将获得的造影剂灌注图像进行编码,观察不同区域造影剂灌注的先后时间。由2名经验丰富的妇科超声医师进行图像分析并行诊断。

1.2.2血清CA125、VAGF水平检测:治疗前采集空腹静脉血,经离心处理获得血清,2h内完成检测,电化学发光法检测血清CA125、VEGF水平。

1.2.3血清miR-125a、miR-200a表达水平的检测:使用3mL惰性分离凝胶凝结管采集患者全血,室温下以4000g离心10min以去除血细胞并收集血清,然后将收集到的血清以16000g离心3min,进一步除去剩余的血细胞,离心后收集血清,并保存在-80℃的冰箱中。将100μL样品加到300μL水中,充分混合后,加入200μL(pH=4.7-5.5)酸性苯酚。剧烈涡旋后,加入200μL氯仿。再次摇匀后,将混合物在室温下以16000g离心15min。将上清液(约400μL)小心地移入800μL异丙醇中,并加入40μL、3M(pH=5.2)乙酸钠。充分混合后,将混合物在-20℃下放置1h,然后在4℃下以16000g离心20min,完全弃掉上清液后,加入1mL的75%乙醇,轻轻颠倒几次,并在4℃下以16000g离心20min。将上清液完全丢弃并在室温下干燥。加入20μL DEPC后,沉淀物溶解并储存在-80℃的冰箱中。按照下列RT-qPCR反应体系进行qRT-PCR检测:TaqMan@SmallRNAAssay(20×)1.0μL,ProductfromRTreaction 2.0μL,TaqMan@UnibersalPCRMasterMixⅡ(2×)10μL,H2O 7μL,cDNA 2μL,共计20μL。反应条件:2min,50℃;95min,10℃;15min,95℃;60min,60℃。扩增条件:10min,95℃;15s,95℃;60s,60℃;40个循环。U6为内参,2-△△Ct法计算miR-125a、miR-200a的相对表达水平。

1.3观察指标:①根据国际妇产科联盟的标准进行术后病理评估并作为金标准,分析TVS-CEUS诊断早期EC的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值及kappa一致性;②比较两组患者血清CA125、VAGF水平;③比较两组患者血清miR-125a、miR-200a相对表达水平。

2 结 果

2.1TVS-CEUS诊断早期EC与术后病理的一致性分析:以术后病理为金标准,TVS-CEUS诊断早期EC的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值及kappa分别为81.67%、71.67%、76.67%、74.24%、79.63%和0.533。见表1。

表1 TVS-CEUS诊断早期EC的效能

2.2两组患者血清CA125、VEGF水平的比较:EC组患者血清CA125、VEGF水平均显著高于对照组患者(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者血清CA125 VEGF水平的比较

2.3两组患者血清miR-125a、miR-200a的相对表达比较:EC组患者血清miR-125a相对表达水平低于对照组患者,miR-200a的相对表达水平高于对照组患者(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者清miR-125a miR-200a的相对表达水平的比较

2.4血清CA125、VEGF水平与miR-125a、miR-200a相对表达水平的相关性分析:Pearson相关性分析:结果显示,患者血清CA125、VEGF水平与miR-125a相对表达水平呈负相关(P<0.05),与miR-200a相对表达水平呈正相关(P<0.05),见表4。

表4 血清CA125 VEGF与miR-125a miR-200a相对表达水平的相关性分析

2.5TVS-CEUS联合血清肿瘤标志物预测模型构建:以病理诊断结果为因变量(“EC”=1,“子宫肌瘤”=0),以TVS-CEUS(“阳性”=1,“阴性”=0)、CA125、VEGF、miR-125a、miR-200a为自变量,纳入二元Logistic回归分析,预测模型为Logit(y)=-3.202+0.489X(TVS-CEUS)+0.547X(CA125)+0.424X(VEGF)-0.580X(miR-125a)+0.658(miR-200a),X表示回归系数,见表5。

表5 VS-CEUS联合血清肿瘤标志物预测模型构建二元Logistic回归分析

2.6TVS-CEUS联合血清肿瘤标志物早期诊断EC的ROC分析:以预测模型所得值、CA125、VEGF、miR-125a、miR-200a为检验变量,以病理诊断结果为状态变量,纳入ROC分析,ROC结果显示:TVS-CEUS联合CA125、VEGF、miR-125a、miR-200a早期诊断EC的AUC显著高于CA125、VEGF、miR-125a、miR-200a单独诊断的AUC(P<0.05),见表6、图1。

图1 TVS-CEUS联合血清肿瘤标志物早期诊断EC的ROC曲线

表6 TVS-CEUS联合血清肿瘤标志物早期诊断EC的效能

3 讨 论

超声造影作为临床使用比较常见的声学造影检查方法,能够在造影剂的作用下测定病灶部位的散射回声、造影参数及血供情况,因而在多种疾病的诊断中均发挥着重要的作用[5]。50%确诊EC的患者处于I期,准确的评估病变的大小、肌层浸润的深度对患者的预后至关重要。目前临床常用的诊断方式虽然能够对EC有明确的诊断,但对肌层侵犯的深度无法做出准确判断,而超声造影则可以有效的展示病灶与子宫肌层的微循环灌注,对病灶良恶性进行评估并通过病灶与子宫肌层微循环的差异为早期EC分期提供依据。本研究结果显示,TVS-CEUS诊断早期EC的灵敏度、特异度、准确度分别为81.67%、71.67%、76.67%,kappa一致性有0.533,具有中度一致性,这主要因为对于不典型的病例患者,即使是超声造影也没法显示出正常肌层与肿瘤侵袭肌层的边界,但相较于一般的超声检查,其诊断效能还是显著提高了,与廖涛等[6]研究结果一致。

除了影像学及病理检查外,分子生物学技术的不断发展促进了血液学诊断方式在恶性肿瘤诊断中的应用,通过一种及多种血清因子辅助疾病筛查在疾病诊断鉴别中具有重要价值。CA125在女性卵巢组织、输卵管及子宫内膜上均有表达,是一种广谱的恶性肿瘤标志物,但其单独诊断的意义不大;VEGF作为影响细胞外基质变形及血管生成的作用因子,目前对于EC的机理研究认为,子宫内膜异常增生后引起细胞间连接受损是CA125释放进入血液,而VEGF则通过增强血管通透性促进血管生成加速癌细胞增殖[7]。本研究结果显示,EC组患者血清CA125、VEGF水平均明显高于对照组患者,但通过ROC分析结果显示,CA125、VEGF用于早期诊断EC的AUC分别为0.651、0.664,效能较低,但李柯[8]的研究认为两者联合诊断EC可在一定程度上弥补单独CA125检测的准确性。血清miRNA将成为一种新的生物标记,已发现在不同体液之间具有不同丰度的miRNA。最近的研究发现,血液循环和其他体液中存在大量稳定的miRNA,血清miRNA可以抵抗核酸酶降解[9]。血清miRNA可以保存很长时间,血清miRNA具有良好的重复性和再现性,在某些疾病状态下,尤其是在肿瘤患者的体液中,某些miRNA的表达会发生特异性变化,并且这些表达谱的特征变化可以被深入研究,体液miRNA将为疾病提供一种新的非侵入性生物标志物,具有良好的临床应用潜力和前景。一项基础研究发现,过表达miR-125a能够促进EC RD95-2细胞凋亡,抑制细胞增殖,但目前临床研究尚未明确miR-125a在血清中的表达水平[10];国外的一项回顾性队列研究结果显示,miR-200a在EC患者中表达明显高于健康对照组,并且与多种miR共同诊断EC的AUC达到了0.958[11]。本研究结果显示,EC组患者血清miR-125a相对表达水平显著低于对照组患者,而miR-200a相对表达水平显著高于对照组,并且相关性分析结果显示,CA125、VEGF水平与miR-125a相对表达水平呈负相关,与miR-200a相对表达水平呈正相关。ROC结果显示,与CA125、VEGF水平的AUC相比,miR-125a与miR-200a早期诊断EC的AUC为0.827、0.851,具有较高的诊断效能,而联合超声造影与4个血清指标后的AUC为0.945,敏感度为90.00%,特异度为94.17%,具有极高的诊断价值。综上所述,TVS-CEUS在辅助早期EC诊断具有一定的价值,单独使用血清肿瘤标志物的效能较低,但联合诊断后的效能较高,可用于早期EC的筛查。