基于非靶标代谢组学的不同烈性酒识别与归类技术研究

◎ 李冠斯，曹晓钢，黄学泓，李志勇，魏 霜

（1.汕头海关技术中心，广东 汕头 515031；2.拉萨海关技术中心，西藏 拉萨 850002；3.广州海关技术中心，广东 广州 510623）

烈性酒作为一种广泛使用的饮料，在全球范围内拥有广泛的消费群体[1]。不同类型烈性酒因其独特的生产工艺、原材料和陈酿方式，具有独特的香气和口感，因此受到了广大消费者的青睐[2]。然而，对于如何根据特征香气物质准确识别和分类不同类型烈性酒，以及如何对其进行科学评价，仍需进一步研究和探讨。近年来，随着分析技术的发展，越来越多的研究开始关注不同类型烈性酒的非靶标代谢物质[3]。这些非靶标代谢物决定了烈性酒的香气和口感，对于评价烈性酒的质量和等级具有重要意义[4]。气质联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）技术作为一种有效的分析方法[5]，能够分离和鉴定烈性酒中的非靶标代谢组学物质，为研究不同类型烈性酒的特征香气物质提供了有力支持[6]。然而，单纯依靠GC-MS 技术对烈性酒进行分析，难以全面揭示其特征香气物质的种类和含量，也无法进行很好的归类识别。因此，本研究利用GC-MS 技术结合聚类分析（Cluster Analysis，CA）、主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）及偏最小二乘法判别分析（Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA）等组学分析手段[7-8]，对6 种不同类型烈性酒的非靶标代谢组学物质进行分析，旨在为我国进出口监管部门在不同类型及品牌烈性酒的识别与归类监管上提供更加科学、可靠的支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

6 个类型的酒样：WSC 系列威士忌酒样（编号为WSC1 ～WSC50）50 瓶、W14 系列威士忌酒样（编号为W141 ～W1450）50 瓶、W18 系列威士忌酒样（编号为W181 ～W1850）50 瓶、MXO 系列白兰地酒样（编号为MXO1～MXO50）50瓶、LXO系列白兰地酒样（编号为LXO1 ～LXO50）50 瓶、HXO 系列白兰地酒样（编号为HXO1 ～HXO50）50 瓶。6 个类型对应的假酒样品（假酒样品来源为厂商收缴所得的市场假冒商品）。样本编号见表1。

表1 不同烈性酒酒样一览表

Agilent 5977B气质联用仪，美国Agilent Technologies公司；实验用水，实验室自制超纯水，Millipore Simplicity 超纯水系统，上海彤迪科学仪器有限公司。

1.2 仪器条件

气相色谱条件：色谱柱为DB-WAX-UI 型弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度40 ℃，保持1.0 min，以5 ℃·min-1的升温速率升至250 ℃，保持10.0 min；进样口温度250 ℃；载气为氦气（纯度≥99.99%）；流速1.0 mL·min-1；分流比10 ∶1。

质谱条件：电子轰击电离源；电离能70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；全扫描监测模式，质量扫描范围35 ～500 amu；溶剂延迟1 min。

1.3 烈性酒的定量与定性

在常规检测任务中，对烈性酒中的非靶标代谢物的定性主要采用标准品直接比对法，然而，在某些特殊情况下，为满足检测快速便捷要求，也可采用质谱库检索对比方式进行[9]。本研究采用质谱库检索对比方式，使用的软件为NIST MS Search v.2.0 和Agilent MassHunter 中 的Qualitative Navigator B.08.00， 将GC-MS 识别的非靶标代谢物与美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）质谱库进行对比，再手动筛选出正、反匹配度大于700、可能性大于90%的非靶标代谢物，同时需满足保留时间在±0.5 s。烈性酒中挥发性成分的定量分析采用相对丰度表示化合物的含量，即使用其质谱峰的峰面积表示含量，因为化合物含量与其相应质谱峰峰面积成正比。

1.4 数据处理

GC-MS 得到的数据先进行归一化处理，再做化学计量学分析，并整理统计和绘图。以上所有分析均使用R 4.2.3 完成。其中使用PCA 包做主成分分析及绘图，使用hclust 包绘制层次聚类，使用ropls 包做偏最小二乘法判别分析。

2 结果与分析

2.1 不同烈性酒非靶标代谢组学物质GC-MS 分析

烈性酒酒样挥发性成分的检测均采用GC-MS 方法，GC-MS 分析总离子流色谱图见图1（a ～f 分别代表6种烈性酒，图中仅展示部分非靶标代谢物名称）。由图1 可知，6 种烈性酒共检测出61 种非靶标代谢物，包括醇类21 种，酯类10 种，酸类14 种，醛酮类6 种。

图1 不同烈性酒酒样中挥发性成分GC-MS 分析总离子流色谱图

通过NIST 质谱图库检索分析，按照不同类型的酒样，得到非靶标代谢组学物质对比图，见图2。从图中可以看出，非靶标代谢组学物质中最多的为酯类化合物和醇类化合物。

图2 不同类型烈性酒非靶标代谢组学物质对比图

采用GC-MS 对不同类型及品牌烈性酒中的非靶标代谢物进行分析，结果表明不同类型及品牌烈性酒中的非靶标代谢物含量和种类差异较大，利用非靶标代谢物这一基础对不同类型及品牌烈性酒进行组学分析是可行的。

2.2 不同烈性酒的挥发性成分聚类分析

聚类分析法是组学分析方法中的重要方法，聚类分析对不同类型及品牌烈性酒中挥发性及非挥发性非靶标代谢物归类与识别研究以及产品等级和划分都具有重要的参考价值[10]。

选取6 种不同类型及品牌烈性酒经过GC-MS 分析，利用检测出的61 种非靶标代谢物进行分析聚类分析（由于样本数较大，此处仅随机选择每种酒的10 个样本），分层聚类方法采用欧氏距离度量，并使用平均值聚类算法。由图3（a）和（b）可知，6 种不同类型及品牌烈性酒分布较为集中，每种烈性酒均可自己归纳为一类。W14、WSC、W18 这3 款酒分布较为集中，说明其非靶标代谢物组成较为相似，初步判定这3 款酒为同类型烈性酒。HXO、MXO 两款酒分布较为集中，与LXO 差异较大，说明其在非靶标代谢物组成上有较大差异，这可能与这3 款酒制作工艺、使用原料、储存时间不同有关。

图3 不同类型的烈性酒酒样中挥发性非靶标代谢组学物质的聚类分析图

2.3 不同种类烈性酒挥发性成分主成分分析

对6 种不同类型及品牌烈性酒数据进行主成分分析，取6 种烈性酒酒中前3 个主成分得分做三维和二维的得分散点图。如图4 所示，主成分分析在6 种烈性酒的区分上具有同聚类分析一样的效果，6 种不同类型及品牌烈性酒在二维和三维的得分散点图中均能有效分开，并无发生重叠现象。从二维散点图可以看出，WSC、W14、W18、MXO 和LXO 这5 种烈性酒相距较近，且W14、WSC、W18 这3 款酒分布均集中在同一象限，而MXO、LXO 和HXO 各单独占据一个象限。同时，还可见HXO 与其他酒距离较远的同时聚集效果较为松散，没有其他5 种类型及品牌烈性酒聚集。

图4 不同类型烈性酒酒样前3 个主成分的三维散点图及二维散点图

2.4 不同类型烈性酒的偏最小二乘法判别分析

在主成分分析的基础上，本研究对6 种不同类型及品牌烈性酒进行PLS-DA 分析，并得到烈性酒非靶标代谢物对应的变量投影重要性（Variable Importance in Projection，VIP）得分。利用6 种不同类型及品牌烈性酒在这2 个成分中的得分做散点图。如图5 所示，WSC、W14 和W18 这3 款酒较为聚集，MXO 和LXO两款酒较为聚集，HXO 聚类效果较为松散，且与其他5 款酒距离较远。

图5 不同类型烈性酒酒样偏最小二乘法判别分析散点图

VIP 量化了每个非靶标代谢物在组学分析中的重要性，VIP 值越高表示在烈性酒组学分析中的差异权重越大，对非靶标代谢物组学归类技术的贡献值越大。本研究选择VIP 值排名前15 的非靶标代谢物进行展示，详见见表2。在6 种不同类型及品牌烈性酒中，VIP值最高的物质为十二烷二酸二甲酯，VIP 值排名前15的非靶标代谢物中，有4 种酯类化合物、3 种醇类化合物、2 种糖类化合物、1 种酸类化合物、5 种其他物质。这些非靶标代谢物对6 种不同类型及品牌烈性酒的归类识别权重较大，可作为烈性酒生产过程中的特征化合物控制指标，也可以应用于进出口烈性酒监管中的酒类归类识别和真实性判别，具有较大研究价值。

表2 VIP 值排名前15 的特征物质一览表

3 烈性酒的归类识别验证

为了进一步验证上述烈性酒非靶标代谢物组学分析技术，本研究从厂商处获取从市场收缴的假冒酒，同样采用聚类分析和PLS-DA分析两种方法进行判定。聚类分析主要观察测试样本与训练集中哪一类样本分布在同一棵聚类树下，如果测试样本单独在一棵聚类树下，则判断为假酒。PLS-DA 分析主要观察散点图中测试样本与训练集中哪一类样本相距较近，从而判断其种类，如果测试样本单独形成一个类，则判断为假酒。

从图6 可以看出，层次聚类中，假酒被单独分到了一个聚类树，而PLS-DA 分析中测试样本距离训练集样本在PC1 及PC2 中的距离均大于1。因此可以得出，通过聚类分析和PLS-DA 分析两种方法均可判定假酒不属于训练集样本中的任一类型，上述烈性酒非靶标代谢物组学分析技术验证为可行。

图6 掺伪烈性酒酒样的判别分析图

4 结论

本研究以非靶向代谢组学技术为基础，通过气质联用技术对6 种不同类型烈性酒的非靶标代谢组学物质进行分析，并结合主成分分析、聚类分析及偏最小二乘法判别分析等化学计量学手段对检测结果进行分析，建立了一套基于非靶标代谢组学的不同烈性酒识别与归类技术。在6 种不同烈性酒共检测出61 种挥发性成分，包括醇类21 种，酯类10 种，酸类14 种，醛酮类6 种，其中，4 种脂类、3 种醇类、1 种酸类、2 种糖类及5 种其他物质造成酒样差异中的权重较大。通过聚类分析、主成分分析及偏最小二乘法判别分析能够很好地归类识别6 种烈性酒。本研究建立了一种适合推广的烈性酒快速归类与识别技术，为酒类产品的真实性鉴定提供参考，有利于加强知识产权保护，该技术能有效打击进出口侵权违法行为，维护公平有序的进出口贸易秩序，为国内外创新主体提供良好的营商环境和有力的法治保障。