锯缘青蟹产组胺菌的分离与鉴定

◎ 陈德强，谢吉红，孙菲霞，黄 丽

（1.北部湾大学，广西 钦州 535011；2.广西高校北部湾海产品高值化利用与预制食品重点实验室，广西 钦州 535011）

锯缘青蟹（Scylla serrata）是我国南方沿海重要的经济水产养殖品种，具有很高的营养与经济价值。近年来，锯缘青蟹养殖业及其贸易发展快速。由于锯缘青蟹具有高蛋白、高水分的生物学特征，在贮运与保鲜过程中极易受到微生物污染而引起腐败。在适宜条件下，蟹体内游离组氨酸经腐败菌的脱羧作用容易生成大量的组胺，引起食用过敏，危害人体健康。同时，组胺含量超标也是制约我国海产品出口贸易的主要瓶颈因素[1]。本研究将从锯缘青蟹中分离筛选产组胺的微生物种类，并对其产组胺能力进行测定，旨在为锯缘青蟹及其产品的保鲜加工和组胺控制提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

锯缘青蟹分别采集于钦州市城东市场（7 份）、东风市场（5 份）和鸿发市场（7 份），共19 份样品。采集的锯缘青蟹样品保存于4 ℃的冰箱备用。

1.2 材料与试剂

化学试剂：组胺标准品、L-组氨酸、正戊醇、对硝基苯胺，购于上海麦克林公司；Bacterial DNA Kit（Omega）；TaqPCR 试剂盒（GenStar）。

产组胺菌初筛培养基：蛋白胨5.0 g、酵母粉5.0 g、氯化钠5.0 g、碳酸钙1.0 g、溴甲酚紫0.06 g、L-组氨酸4.0 g、琼脂粉20.0 g、蒸馏水1 L，调pH 值为5.3。

产组胺菌复筛培养基：L-组氨酸10 g、NaCl 5 g、磷酸吡哆醛0.01 g、溴甲酚紫0.06 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，调pH 值为5.3。

组胺检测培养基：L-组氨酸10.0 g、蛋白胨15.0 g、NaCl 3.0 g、K2HPO42.5 g、丙酮酸钠10.0 g、葡萄糖2.5 g、蒸馏水1 L，调pH 值为6.0。

1.3 仪器与设备

高速离心机（德国Hettich，Universal 320）；恒温培养箱（上海合恒，DHG-9030A）；PCR 仪（Thermo，ProFlex 3×32 孔）；分光光度计（Thermo，Evolution 201）；电泳仪（北京六一，DYY-6C）；凝胶成像系统（美国SIM，Bio-best135A）。

1.4 试验方法

1.4.1 产组胺菌分离筛选

参照陆踊南等[2]方法，无菌条件下将锯缘青蟹研磨均匀，称取10 g 研磨组织加入90 mL 生理盐水，得到10-1稀释液，并依次进行10 倍梯度稀释得到系列稀释液。吸取1 mL 稀释液于灭菌培养皿中，倒入约15 mL初筛培养基混匀，凝固后37 ℃培养48 h；挑取变紫色的菌落划线接种于复筛培养基上，37 ℃培养48 h 后，再次观察，变紫色的菌落则为产组胺细菌。

1.4.2 组氨酸脱羧酶hdc基因检测

按Bacterial DNA Kit（Omega）说明书操作提取各菌株DNA，采用JAW 等[3]设计的hdc引物进行扩增检测，预期片段大小1 380 bp 左右。引物：hdc-F：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，hdc-R：GTGTGACGG GCGGTGTGTAC。PCR 体系：2×taqMix 10 μL，正反引物各1 μL，DNA 1 μL，补dd H2O 至20 μL。PCR 程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min。

1.4.3 产组胺菌16S rDNA 鉴定

采用细菌通用引物27 F、1492 R 进行16S rDNA PCR 扩增，扩增体系、程序与hdc检测方法相同。扩增产物送往上海生工进行序列测定，序列信息提交至NCBI 数据库进行比对分析。

1.4.4 产组胺能力检测

将各菌株分别接种于组胺检测培养基中，30 ℃、150 r·min-1条件下培养48 h。吸取20 mL 培养液至50 mL离心管中，5 000 r·min-1离心5 min，移取10 mL 上清液进行组胺含量检测。检测方法参照国家标准《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》（GB 5009.208—2016）方法进行。

2 结果与分析

2.1 产组胺菌分离筛选

在采集的19 份样品的初筛培养过程中共获得56 株呈紫色的菌株，但为了排除细菌利用各类氨基酸产生其他生物胺致使培养基呈色的可能，本试验对初筛菌株进行了复筛，经过复筛培养，最终分离得到24 株产组胺菌株（编号H1～H24）（图1）。

图1 部分产组胺菌在复筛培养基上的呈色特征图

2.2 产组胺菌hdc 检测与16S rDNA 鉴定

组氨酸脱羧酶hdc基因检测结果显示，H1～H24均能扩增出一条约1 380 bp 的亮带（图2A），与目的条带大小一致。16S rDNA 电泳结果显示，H1～H24在1 500 bp 处均出现一条明亮目的条带（图2B），符合预期大小。PCR 产物送往上海生工进行测序。

图2 hdc 基因与16S rDNA PCR 扩增电泳图

16S rDNA 同缘比对结果表明，24 株产组胺菌共鉴定为9 个属15 个细菌种（相似度＞99%），其中Acinetobacter baumannii分离率最高，有6 株，占比为25.0%，为优势分离菌种；其次是Klebsiella pneumoniae，有3 株，其余13 个菌种分别为1 ～2 株（图3）。

图3 菌株H1 ～H24 16S rDNA 同缘比对分析图

2.3 产组胺能力检测

结果显示（图4），H1～H24菌株发酵上清液均检出不同浓度的组胺含量，24 株产组胺菌发酵上清液的组胺含量在22.74 ～45.05 mg·L-1，平均含量为33.97 mg·L-1。产组胺含量超过40 mg·L-1的菌株有4 株（H7、H20、H23、H24），其中菌株H20（Aeromonas hydrophila）发酵上清液的组胺含量最高（45.06 mg·L-1），产组胺能力较强。

图4 产组胺菌H1 ～H24 发酵上清液中组胺含量测定图

3 结论与讨论

组胺是对人体健康危害最大的生物胺之一，每年都有许多国家和地区爆发组胺中毒事件。有研究表明，许多微生物能引起水产品产生组胺，如发现有Enterobacteria aerogenes、Hafnia alvei、Kelbsiella pneumoniae等 高 产 组 胺 菌；Vibrio alginolyticus、Pseudomonas fluorescens、Clostridiumspp.等低产组胺菌。因此，加强水产品中产组胺菌的检测与控制对保证水产品安全质量和营养价值具有重要意义[4-5]。

本研究从锯缘青蟹中分离得到24 株产组胺细菌，均携带组氨酸脱羧酶hdc基因。经同缘鉴定，Acinetobacter属的细菌有10 株，其中Acinetobacter baumannii为优势分离菌种；24 株产组胺菌发酵上清液的组胺含量在22.74 ～45.05 mg·L-1，产组胺能力相对较强。研究结果对有效控制锯缘青蟹的产组胺关键菌，保障锯缘青蟹产品食用安全具有重要参考意义。