GC-MS 法测定油茶籽油中10 种甾醇的含量

◎ 左靖文，黄诗怡，罗春花，杨学军，杨 静，周 峰，周建洋

（1.衡阳市市场监督检验检测中心，湖南 衡阳 421200；2.衡阳师范学院 化学与材料科学学院，湖南 衡阳 421008）

植物甾醇是一种三萜化合物，主要存在于植物种子中，以游离型脂肪酸酯、糖苷、脂肪酰基糖苷的形式存在。据报道，目前已从植物中鉴别出250 多种植物甾醇[1]。常见的甾醇化合物有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇。植物甾醇可以降低动脉粥样病变的严重程度，降低高胆固醇血症患者血清胆固醇水平，通过减少胆固醇的吸收，降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平[2-3]。植物甾醇还具有预防心血管疾病、消炎、抗肿瘤和调节免疫等功效。近年来，植物甾醇在食品、医疗、化工等领域备受关注，需求量不断增加。因此，建立一种高效、快捷、准确和成本低的甾醇化合物分析方法具有重要意义[4]。目前，常用的甾醇分析技术分为气相色谱法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法，其灵敏度高低可能因甾醇结构和与色谱仪器耦合的检测器而异[5]。毛细管气相色谱法已成为检测甾醇化合物的首选方法，大部分甾醇在DB-5 或RTX-1701 毛细管柱上有着极好的分离[6]。未经衍生的甾醇也可经GC-FID 或MS 检测，但是经硅烷化衍生后再测定能获得更好的峰形、分辨率、灵敏度，且热不稳定的不饱和甾醇具有更高的稳定性[7]。

测定油茶籽油中甾醇含量可以增加人们对其功能性成分的认识。本课题初步探讨了油茶籽油中甾醇的检测方法的建立，为建立油茶籽油中甾醇指纹图谱提供一定的技术和数据支持，为茶籽油质量标准提升提供依据，为解决油茶籽油掺伪难题提供一定的数据参考，保障油茶产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1#～16#油茶籽油样品；胆固醇、固甾烷醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、高根二醇、熊果醇、羽扇豆醇、α-香树脂醇和羊毛甾醇等标准品（纯度≥97%），斯坦福化学有限公司；二氯甲烷、正己烷、乙醇、氢氧化钾和无水硫酸钠等试剂，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺和1-甲基咪唑（纯度97%），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；二氧化硅固相萃取柱（0.5 g/3 mL），北京美正检测技术有限公司；实验用水均为一级纯水。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B 气相色谱质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；E204 电子天平，梅特勒托利多科技有限公司；电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；水浴氮吹仪，上海安谱科学仪器有限公司；真空泵，天津津腾实验设备有限公司；电子万用炉，北京永光明医疗仪器有限公司，Mμltifuge X1R 高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工作曲线配制

准确称取胆固醇、豆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、α-香树脂醇、高根二醇、羽扇豆醇和熊果醇标准品各10 mg（精确至0.1 mg），放于同一10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷溶解，定容至刻度线，得到1 mg·mL-1混合标准储备溶液。准确称取胆甾烷醇标准品10 mg（精确至0.1 mg），用二氯甲烷溶解，定容至10 mL，得到1 mg·mL-1内标储备溶液。取适量的储备液用正己烷定容，最终标准曲线溶液梯度为0 μg·mL-1、2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、20 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1，每个梯度内标溶液浓度均为20 μg·mL-1。

1.3.2 试样制备

准确称取0.1 g（精确至0.000 1 g）油茶籽油样品于25 mL 磨口圆底烧瓶中，加入100 μL 胆甾烷醇内标中间溶液（200 μg·mL-1），加入3 mL 二氯甲烷、10 mL 的0.5 mol·L-1氢氧化钾-乙醇溶液，摇匀。在圆底烧瓶上连接好回流冷凝器，加热，保持混合液微沸15 min。将皂化液转移至50 mL 离心管，加入7 mL去离子水和10 mL 二氯甲烷，充分摇匀，置于高速冷冻离心机8 000 r·min-1离心5 min，除去上层水相。有机相用10 mL 去离子水洗涤3 次，直至溶液变清澈，45 ℃氮吹。浓缩至1 mL 左右，转移至反应瓶（气相或液相2 mL 进样瓶），盖垫，完好密封。用氮气吹干，加入100 μL 硅烷化试剂（在950 μL N-甲基-N-三甲基硅烷七氟丁酰胺中加入50 μL 1-甲基咪唑），拧紧反应瓶盖，涡旋混匀。将溶液置于105 ℃培养箱中反应15 min，冷却至室温后加入正己烷，定容至1 mL，进气相质谱分析。标准系列混合工作溶液取1 mL，硅烷化反应同上（转移至反应瓶）。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：DB-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：流速为0.7 mL·min-1的氦气，载气模式为不分流；进样口温度：320 ℃；进样量：1 μL；柱温箱升温程序：初始温度180 ℃，保持1 min，以4 ℃·min-1的速度升到300 ℃，再保持25 min；离子源温度：250 ℃；传输线温度：300 ℃。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 色谱条件优化

本研究比较了分流衬管（安捷伦5180-2295）和不分流衬管（安捷伦5180-2293）在分流模式和不分流模式下的检测效果。结果表明，采用分流衬管，分流比40 ∶1 模式下，甾醇物质灵敏度低，低浓度标准溶液响应差，标曲线性差，相关系数低于0.995；使用不分流衬管，不分流模式，灵敏度较好，标曲线性良好，能满足检测要求。因此本研究采用不分流衬管，不分流模式进行测定。本研究还考察了进样口、色谱柱、传输线等的温度对测定结果的影响，结果表明，在一定范围内，随着温度升高，甾醇（三甲基硅醚）物质的响应强度略微增加，可能是因为甾醇是高沸点物质，提高检测温度有利于目标物的气化和传输。综合考虑色谱柱的温度耐受性和使用寿命，最终确定进样口温度为320 ℃、传输线温度为300 ℃，色谱柱初始温度为180 ℃，色谱条件见1.3.3。

2.1.2 质谱条件的确定

将高浓度的混合标准溶液、内标溶液进行气相质谱测定，使用Scan 全扫描模式，荷质比50 ～650，通过NISI 14 谱库进行比对，确定每种甾醇（三甲基硅醚）化合物的保留时间。选择质量数大，信号强度高的离子碎片作为定量离子和定性离子。根据保留时间和定量定性离子，设定SIM 选择离子监测模式条件进行分析实验。甾醇（三甲基硅醚）化合物的定量离子和定性离子见表1，标准品总离子流图见图1。

图1 标准品甾醇（三甲基硅醚化合物）GC-MS 总离子流图

表1 甾醇（三甲基硅醚）的定量离子和定性离子表

2.2 方法学评价

2.2.1 线性关系、检出限、定量限

本方法采用Sim 分段时间，选择离子监测模式，按照1.3.3 仪器最佳工作条件进行分析。内标法定量，通过仪器定量分析软件绘制工作曲线，得到线性回归方程和相关系数R。在多个空白样品中逐级加入一定量的标准品，样品皂化、硅烷化后进行气相质谱分析，当信噪比（S/N）约为3 时，得出各甾醇的检出限；当S/N约为10 时，得出各甾醇的定量限。所有待测甾醇化合物在其线性范围内线性良好，相关系数均大于0.998。方法检出限为0.22 ～2.31 mg/100 g，定量限为0.73 ～7.69 mg/100 g。样品量0.1 g，定容体积1 mL，甾醇化合物的检出限和定量限见表2。

表2 甾醇化合物线性方程、相关系数、检出限、定量限表

2.2.2 准确度和精密度

本研究选择空白样品加标回收实验验证方法准确度，根据样品定量限分别进行低、中、高3 水平6 平行加标回收实验，回收率和精密度结果见表3。结果表明10 种甾醇化合物的回收率为89.1%～106.8%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为0.19%～2.33%（n=6），该方法准确度和精密度均能满足分析要求。

表3 加标回收率与精密度表（n=6）

2.3 样品测定

本研究油茶籽油样品测定结果见表4，油茶籽油中β-谷甾醇、羽扇豆醇含量较高，胆固醇、菜油甾醇、高根二醇含量较低。不同样品测定结果表明油茶籽的品种、产地不同会导致其甾醇含量有所差异，菜籽甾醇、熊果醇几乎在油茶籽油中均未检出，这两种有望作为油茶籽油品质掺假鉴别的指标。

表4 油茶籽油甾醇测定结果表 单位：mg·kg-1

3 结论与讨论

本研究建立了GC-MS 测定油茶籽油中10 种甾醇的方法，该方法优化了前处理流程，缩短了时间，提高了效率。通过优化气相质谱条件，降低了检出限和定量限，提高了检测灵敏度，该方法标曲线性良好，回收率和精密度能满足检测要求，适用于油茶籽油中10 种甾醇的快速测定。