猪肉中磺胺类药物的检测

◎ 田 翠，张维娜，罗小娇，郑海芳，张 强，金 伟，刘 霜

（泸州市农业农村局，四川 泸州 646000）

磺胺类药物是具有氨基苯磺酰胺结构的一类抗菌药物的总称，其粉末一般为黄色或白色，基本无味。磺胺类药物可以抑制细菌的生长和繁殖，具有价格低、抗菌能力强、容易吸收等特点，被广泛用于兽医临床和畜牧业，以预防和治疗畜禽细菌性疾病，但磺胺类药物的不合理使用、误用，甚至滥用，导致细菌的耐药性日益增强[1-6]。磺胺类药物可以影响泌尿系统功能，甚至诱发癌变。磺胺类药物代谢时间较长，一旦人们长期服用带有磺胺类药物残留的食品，磺胺类药物会在人体内富集，富集浓度超过一定量对人体有害。《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中规定磺胺类药物及其残留标志物之和不得超过100 μg·kg-1[7]。

目前，肌肉组织中磺胺类药物的检测方法很多，主要有毛细管电泳分析法、酶联免疫吸附法、放射性免疫法、高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法等[8-16]。本文提出了乙酸乙酯提取，0.1 mol·L-1的盐酸溶液转化溶剂，正己烷除脂肪，MCX 柱净化，外标法定量，采用高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉样品中5 种磺胺类药物的方法，其背景干扰少，灵敏度高，重复性好，能快速、高效、高分辨地定性、定量检测，该方法适用于大批量的猪肉中磺胺类药物的检测，可为日常监测和风险检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

磺 胺 二 甲 基 嘧 啶（Sulfamethazine，SM2）100 μg·mL-1、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）100 μg·mL-1、磺胺甲恶唑（Sulfamethoxazole，SMZ）100 μg·mL-1、磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）100 μg·mL-1和磺胺喹恶啉（Sulfaquinoxaline，SQX）100 μg·mL-1；试剂用纯净水（屈臣氏纯水）；乙酸乙酯、甲醇、正己烷、甲酸、乙腈均为色谱纯；盐酸、氨水为优级纯；0.1 mol·L-1盐酸溶液（量取0.83 mL 浓盐酸，倒入适量的纯水中，加水稀释至100 mL，摇匀）；洗脱液（量取5 mL 氨水，倒入适量的甲醇中，加甲醇稀释至100 mL，摇匀）；5%的甲醇溶液（取5 mL 甲醇，用水溶解后稀释至100 mL，摇匀）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱-串联质谱联用仪（安捷伦6460）；涡旋振荡器；高速离心机（冷冻）；MCX 柱60 mg/3 mL（岛津）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

取新鲜或解冻的猪肉若干小块或全部样品预处理，切碎、混匀，四分法缩分。取缩分样品，充分匀浆，分别装入洁净塑料瓶中密封，标识。

1.3.2 测定步骤

（1）提取。称取样品（5.0±0.05）g 于50 mL 的离心管中，加入一颗陶瓷均质子和20 mL 乙酸乙酯，剧烈振荡2 min，5 000 r·min-1离心5 min（离心机温度设置-2 ℃左右），用滴管将上清液吸取到50 mL的鸡心瓶中，残渣中加入20 mL 乙酸乙酯，按步骤重复提取1 次，2 次提取液合并后备用。

（2）净化。将4 mL 的0.1 mol·L-1盐酸溶液加到鸡心瓶中，40 ℃旋蒸至溶液不分层（乙酸乙酯旋出，只剩盐酸溶液），将残留的溶液转至50 mL 的离心管中，用2 mL 的0.1 mol·L-1盐酸溶液洗涤鸡心瓶2 次，将洗涤液转移至同一个离心管中，再用5 mL 的正己烷洗涤鸡心瓶，并转移至含有盐酸溶液的离心管中，涡旋振荡1 min，5 000 r·min-1离心5 min（离心机温度设置-2 ℃左右），用一次性滴管将正己烷吸出弃去。MCX 柱分别用2 mL 甲醇和2 mL 的0.1 mol·L-1盐酸溶液活化，取备用液过柱，依次用1 mL 的0.1 mol·L-1盐酸溶液和2 mL 甲醇淋洗，弃去流出液体，当MCX柱液面没有液体时，加入6 mL 洗脱液，用10 mL 试管收集洗脱液。将洗脱液40 ℃氮气吹至近干，加5%的甲醇溶液溶解残渣，涡旋混匀，0.2 μm 滤膜过滤，液相色谱-串联质谱测定。

1.3.3 标准溶液的配制

（1）5 μg·mL-1磺胺类混合标准储备液。分别准确吸取0.50 mL 的100 μg·mL-1的5 种磺胺标准品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，配制成5 μg·mL-1的磺胺类混合标准储备液，-20 ℃以下的冰箱中保存。

（2）1 μg·mL-1磺胺类混合标准工作液。准确吸取2.00 mL 的5 μg·mL-1磺胺储备液于10 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，配制成1 μg·mL-1的磺胺类混合标准工作液，-20 ℃以下的冰箱中保存。

（3）标准曲线制备。准确吸取1 μg·mL-1磺胺类混合标准工作液，用5%的甲醇溶液配制成10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的标准使用液，4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱为安捷伦C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为甲醇；柱温35 ℃；进样量2 μL；流速0.2 mL·min-1。色谱柱梯度淋洗条件见表1。

表1 梯度淋洗条件表

质谱条件：离子源AJS ESI；正离子模式；多反应监测；雾化器压力45 psi；干燥气温度250 ℃；鞘气温度350 ℃；毛细管电压4 000 V。定量定性离子、保留时间等参数见表2。

表2 磺胺类药物的主要液质参数表

2 结果与分析

2.1 方法选择

目前，肌肉组织中磺胺类药物的检测方法主要有酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法，其中酶联免疫吸附法重复性和稳定性较差，易造成假阳性的误判；《食品安全国家标准 动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定 高效液相色谱法》（GB 29694—2013）中的高效液相色谱法检出限高，根据保留时间定性，仪器不稳定或有杂质峰的影响，会出现误判的情况，且为达到较好的分离效果一般选用C18色谱柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），流动相梯度淋洗时间较长，不利于大批量样品的上机处理；《畜禽肉中16 种磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 20759—2006）采用乙腈提取，无水硫酸钠吸水，虽然操作简单，但是无水硫酸钠吸水时，对磺胺类药物也有一定的吸附作用，导致回收率降低，且没有经过固相萃取柱的净化，会对液相色谱的管道和色谱柱造成污染，也会对质谱的离子源造成污染；《动物源食品中磺胺类药物残留检测 液相色谱-串联质谱法》（农业部1025 号公告—23—2008）中洗脱液有75%的水，低温氮吹时很难吹干，高温氮吹时磺胺类药物易分解，导致回收率低和精密度差。本文用乙酸乙酯提取，0.1 mol·L-1酸溶液转化溶剂，正己烷除脂肪，MCX 柱净化，5%的氨水甲醇洗脱，氮吹至近干，操作简单，定性、定量准确。

2.2 浓缩

浓缩时将乙酸乙酯全部蒸干，再加盐酸溶液，少量多次转移，磺胺类药物回收率降低。乙酸乙酯蒸干后，脂类物质粘壁，磺胺类药物也粘壁，导致转移不彻底，回收率降低。在提取液中加入盐酸溶液，根据盐酸溶液和乙酸乙酯的沸点不同，先将乙酸乙酯蒸去，大部分磺胺类药物溶解在盐酸相中，再用正己烷分2 次洗鸡心瓶，可以把脂肪和少量粘在壁上的药物转移出来。旋转蒸发时控制水浴温度40 ℃（水浴温度过高，热不稳定的药物会分解，回收率降低；水浴温度过低，旋转蒸发的时间较长，不利于大批量样品的检测），减压干燥至收集瓶中无大量液滴滴下，所剩体积大约为4 mL。

2.3 除脂肪

使用正己烷脱脂时，涡旋时间不宜过长，涡旋力度也不宜过大，否则溶液会发生乳化现象。萃取中应防止乳化现象，以免乳状液中溶解的磺胺类药物不能回收，降低回收率，影响重复性。一旦发生乳化，需要消除乳化，常用的破乳方法有离心、加热、超声、冷冻和加盐等，待乳化消失再过柱。

2.4 净化

磺胺类药物呈酸碱两性，易溶于酸液和碱液中，故可使用离子交换SPE 柱作为净化富集的手段。本方法用MCX 柱，MCX 小柱可以提供反相保留和离子交换两种模式，适用于碱性化合物的阳离子交换和反相吸附。上样步骤及溶液使用原因如下。

2.4.1 活化

加入甲醇浸润柱子，并除去柱内杂质，盐酸溶液可以创造一个样品溶剂相容环境，为待测组分的上样和淋洗做好准备。

2.4.2 上样

根据离子化原理，上样液的pH 值应低于待测组分pH 值，绝大部分的待测组才可解离为离子，所以选择酸性较大的水溶液为上样液。

2.4.3 淋洗

用盐酸溶液淋洗，可以解除药物与基质蛋白的结合，使药物继续保持于柱体上，再用甲醇淋洗，去除较多的极性杂质。

2.4.4 洗脱

洗脱液过少，洗脱不完全会导致回收率偏低；洗脱液过多，杂质可能洗脱下来，干扰上机检测，且洗脱液过多，氮吹较慢，不利于大批量样品的检测。本方法选择6 mL 的洗脱液。

2.4.5 氮吹

氮吹不宜吹干，吹干后回收率降低、重现性变差，原因在于没有溶液的保护，磺胺类药物分解或被吹跑。氮吹至液面近干，回收率高、重现性好。

2.4.6 复溶

样品浓缩后，复溶溶剂的选择直接影响实验结果。复溶不充分会导致回收率降低和重现性差。一般复溶液最好与流动相的初始比例相同，避免对检测产生干扰。本方法初始流动相是5%的甲醇溶液，此溶液对磺胺类药物的溶解性好，因此选择5%甲醇溶液溶解残渣。

2.5 标准曲线

配制标准浓度系列曲线，5 种磺胺类药物用5%的甲醇溶液配制成10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的标准混合溶液，上机测试。以进样浓度为横坐标，以峰面积的响应值为纵坐标，绘制标准曲线，相关系数为0.999 3 ～0.999 9，线性关系良好，均大于0.999。以10 倍信噪比确定5 种磺胺类的定量限，5 种磺胺类的定量限均为1 μg·kg-1，说明该方法的灵敏度满足药物残留分析的要求，标准曲线相关系数及定量限见表3。

表3 标准曲线相关系数表

2.6 回收率和精密度

在猪肉基质中添加浓度为10 μg·kg-1、40 μg·kg-1、60 μg·kg-1和100 μg·kg-1的磺胺类混合标准溶液，测定回收率，每个添加水平测定3 次，回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）结果见表4。兽药残留检测的方法一般要求回收率在60%～120%，相对标准偏差一般≤15%（RSD ≤15%）。5 种磺胺类药物的回收率均在61%～87%，相对标准偏差在2.12%～4.96%，符合兽药残留检测规范要求。

表4 添加回收率和相对标准偏差表

3 结论

本方法建立了猪肉中磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑和磺胺喹恶啉5 种常用的磺胺类药物的液相色谱-串联质谱法的检测方法。该方法具有良好的线性关系，定量限为1 μg·kg-1，在10 μg·kg-1、40 μg·kg-1、60 μg·kg-1和100 μg·kg-1的加标水平上，回收率为61%～87%，RSD 为2.12%～4.96%，准确、高效，适用于大批量样品的定性和定量检测，为猪肉中磺胺类药物的检测提供了有效的技术支撑。