柱前衍生-高效液相色谱法测定冷饮中的甜蜜素

◎ 毛小庆，方 猛，孙 涓

（马鞍山市产品质量监督检验所，安徽 马鞍山 243000）

甜蜜素又称环己基氨基磺酸钠，其甜度是蔗糖的30 ～40 倍[1]，因价格低廉、稳定性较好，常作为甜味剂用于食品生产中。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[2]中规定了冷冻饮品等19 类食品中甜蜜素的最大使用量。目前，对甜蜜素检验的色谱方法有气相色谱法[3-6]、液相色谱法[7-8]、液质联用法[9-10]。其中，气相色谱法样品衍生化时需冰浴30 min，且目标峰较难分开；液质联用法只适用于各种酒类的检测，适用范围较窄，检测成本较高。因此，本文用次氯酸钠衍生化甜蜜素，经正庚烷萃取后，采用高效液相色谱法测定，方法干扰小、定量准确。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

冷饮样品：绿色心情，70 g/支，购于本地市场；甜蜜素标准品，纯度为99%，Dr. Ehrenstorfer 公司。

1.2 仪器与设备

1200 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；WH-3 涡旋振荡器，上海沪西分析仪器厂有限公司；CQ-300B-S 超声波清洗机，上海跃进医用光学器械厂；AL204 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Direct-Pure 型超纯水机，上海乐枫生物科技有限公司；HC-3018R 离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 溶液的配制

硫酸溶液（1 ∶1，V∶V）：量取50 mL 硫酸，边倒边搅拌，倒入50 mL 水中，冷却备用。碳酸氢钠溶液（50 g·L-1）：称取碳酸氢钠50 g，加入少量水溶解，稀释至1 000 mL。硫酸锌溶液（300 g·L-1）：称取硫酸锌30 g 溶于水中，稀释至100 mL。亚铁氰化钾溶液（150 g·L-1）：称取亚铁氰化钾15 g，加入少量水溶解，稀释至100 mL。

1.4 实验方法

1.4.1 标准工作溶液的配制

准确称取0.280 6 g 甜蜜素标准品溶于水中并定容至50 mL，得到浓度为5.00 mg·mL-1的甜蜜度标准储备液。准确移取标准储备液10.0 mL至50 mL容量瓶中，用水稀释并定容，得到浓度为1.00 mg·mL-1的甜蜜素标准中间液。将标准中间液用水稀释为10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1的标准工作浓度。

1.4.2 样品提取

称取冷饮5 g 至50 mL 离心管中，加入约30 mL水，混匀，分别加入2 mL 硫酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液作为沉淀剂，混匀并超声30 min，离心3 min（3 000 r·min-1），将上清液转移至50 mL 容量瓶中，重复上述操作，合并上清液，定容。

1.4.3 衍生化

移取上述试样溶液10.0 mL 至50 mL 离心管中，分别加入硫酸溶液2.0 mL、正庚烷5.0 mL、次氯酸钠溶液1.0 mL，剧烈振荡2 min，静置分层。除去下面水层后，加入碳酸氢钠溶液25 mL，振荡约1 min，以调节溶液pH 值。静置分层，取上层有机相过膜，待上机。标准工作溶液的衍生化同试样溶液。

1.4.4 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水=70 ∶30；进样量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测器是DAD；检测波长：314 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的优化

取衍生后的甜蜜素标准溶液，浓度为100 μg·mL-1，使用紫外分光光度计在200～350 nm处进行扫描测定。结果显示，在314 nm 处吸收峰值较优且无干扰峰，因此确定检测波长为314 nm。

2.1.2 流动相比例的优化

考察不同流动相比例（乙腈-水=90 ∶10、乙腈- 水=80 ∶20、乙 腈- 水=70 ∶30、乙 腈- 水=60 ∶40）对检测结果的影响。结果显示，流动相为乙腈-水=70 ∶30 时基线较稳定且杂质干扰小，标准品衍生物的保留时间为7.952 min，峰形良好，色谱图见图1。

图1 甜蜜素标准品色谱图（浓度：50 μg·mL-1）

2.2 标准曲线

对甜蜜素标准工作溶液进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图2 所示。甜蜜素的线性回归方程为y=2.289 9x-1.449 4，R2=0.999 9。

图2 甜蜜素标准曲线图

2.3 回收率与精密度实验

对衍生后的冷饮样品进行测定，得出冷饮中甜蜜素的含量为0.109 g·kg-1。分别向冷饮样品中添加0.05 g·kg-1、0.15 g·kg-1、0.20 g·kg-1的甜蜜素标准品，测定回收率和RSD，结果见表1。甜蜜度的加标回收率为96.33%～99.83%，RSD 为0.73%～0.96%，方法的回收率和RSD 均满足实验要求。

表1 回收率和精密度实验结果表（n=6）

2.4 实际样品的检测

在本地市场上购买冷饮样品，采用本方法进行测定，色谱图见图3。冷饮中甜蜜素的含量为0.108 g·kg-1，满足GB 2760—2014 的限量要求。

图3 冷饮中甜蜜素的色谱图

3 结论

本文建立了冷饮中甜蜜素的高效液相色谱检测方法，对色谱条件进行了优化。该方法在线性范围内线性关系良好，准确度和精密度均满足检测要求，具有前处理操作简单、抗干扰能力强等优点，可用于测定冷饮中的甜蜜素含量。