液相色谱质谱联用法测定洋葱中槲皮素含量

◎ 黄彩凤，王双娄

（百色市食品药品检验所，广西 百色 533000）

洋葱是大众餐桌的饮食常客。研究表明，洋葱的活性成分槲皮素具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎等功效，可以清除自由基、杀灭细菌，还能调节自噬改善阿尔茨海默病[1-4]。洋葱的产地不同，槲皮素含量也不同。

目前对槲皮素的提取方法主要有超声提取法、回流提取法、微波提取法等，含量测定方法有紫外分光光度法、液相色谱法[5-8]、毛细管电泳法等，其中运用最多的分析方法为高效液相色谱二极管阵列法。由于洋葱本身所含物质比较复杂，在分析过程中容易受到其他成分干扰。基于此，本文运用液相色谱质谱联用仪的高分辨功能快速筛查目标峰，简化提取方法，具有操作便捷、灵敏度高、稳定性好等优点。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

WatersTQD 液 质 联 用 仪；MeTTLER TOLEDO XS205DU 电子分析天平；SHIMADZU TXB622L 电子天平；heidolph 自动涡旋混合器；thermo scientific 冷冻高速离心机；KUDOS 超声仪；甲醇（色谱纯）；乙醇（色谱纯）；槲皮素标准物质（含量：98.6%；批号：100081-201509；厂家：中国食品药品检定研究院）。

1.2 仪器条件

（1）色谱条件。Waters XBridge BEH C18色谱柱（2.5 μm×100 mm，1.7 μm），流动相：0.1%甲酸-甲醇（35 ∶65，V∶V）；等度洗脱；进样量：1 μL；流速：0.25 mL·min-1；柱温：30 ℃。

（2）质谱条件。离子化方式：电喷雾离子化（ESI），正离子模式；电喷雾电压：5 500 V；离子源温度：350 ℃；检测方式：多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；定量方式：外标法；本实验选取质荷比302.84 为母离子，153.018 为定量离子，228.94 为定性离子。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的制备及保存

取新鲜红洋葱样品2 kg 切碎，用高速破壁机打碎混匀，置于-18 ℃条件下保存。

1.3.2 试样前处理

称取样品1.0 g（精确至0.001 g）于50 mL 具塞离心管中，准确加入40 mL 95%乙醇，涡旋振荡5 min，于60 ℃下超声120 min，再以8 000 r·min-1的转速离心5 min，取上清液过0.22 μm 尼龙滤膜后上机测定。

1.3.3 溶液配制

准确称取10.45 mg 槲皮素标准物质于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1.030 mg·mL-1的槲皮素标准储备液，于0 ～4 ℃冰箱中保存。

准确吸取0.50 mL 1.030 mg·mL-1的槲皮素标准储备液于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成5.15 μg·mL-1的槲皮素标准中间液。再根据实验需要分别吸取上述标准中间液置于10 mL 容量瓶中，定容至刻度，配制成10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、150 ng·mL-1、200 ng·mL-1和250 ng·mL-1系列标准溶液。

1.3.4 提取条件的考察

（1）提取溶剂的考察。槲皮素微溶于冷乙醇，易溶于热乙醇，可溶的有机试剂有甲醇、乙酸乙酯、吡啶和丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿和石油醚等，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水，因此本实验考察了100%甲醇、90%甲醇、70%甲醇、60%乙醇、95%乙醇和100%乙醇共6 种提取溶剂的提取效果。分别称取6 份1.00 g 的红洋葱，分别置于50 mL 聚乙烯离心管中，分别加入40 mL 以上6 种溶剂，涡旋混匀，在常温以及超声时间为90 min 的条件下超声，超声过后取出样品，于40 000 r·min-1离心6 min，取上清液进行质谱分析。

（2）提取温度的考察。准确称取1.00 g 红洋葱样品，加入95%乙醇40 mL，涡旋混匀，分别在温度为60 ℃、90 ℃，超声时间为90 min 的条件下超声，超声后取出样品，于40 000 r·min-1离心6 min，取上清液进行质谱分析。

（3）超声时间的考察。准确称取1.00 g 红洋葱样品，加入95%乙醇40 mL 作为提取溶剂，涡旋混匀，在60 ℃以及超声时间为90 min、120 min 的条件下超声，超声后取出样品，于40 000 r·min-1离心6 min，取上清液进行质谱分析。

2 结果与分析

2.1 槲皮素母离子的确证

槲皮素的分子量为302，在正离子模式下对所制备的标准溶液进行质谱全扫描，优化后得到母离子为302.84，碎片离子153.018 响应值最高，因此作为本实验定量离子。此外，选取228.94 作为定性离子，保留时间为3.14 min。详见图1、图2。

图1 对照品谱图

图2 洋葱样品谱图

2.2 提取溶剂的选择

如图3 所示，在其他提取条件均相同的情况下，使用95%乙醇作为提取剂时，红洋葱中槲皮素的提取率最高，因此本文选择95%乙醇作为提取溶剂。

图3 提取溶剂对比图

2.3 提取温度的选择

由图4 可知，在提取溶剂为95%乙醇、超声时间为90 min 的条件下，超声温度为60 ℃时槲皮素的提取率高于常温状态下的提取率，因此本文选择提取温度为60 ℃。

图4 超声温度对比图

2.4 超声时间的选择

如图5 所示，在提取溶剂为95%乙醇、超声温度为60 ℃的条件下，超声时间为120 min 时槲皮素的提取率较高，因此本文选择样品超声时间为120 min。

图5 超声时间对比图

2.5 标准曲线

标准系列溶液按1.3.3 方法配制，以峰面积为纵坐标，以标准样品浓度为横坐标绘制标准曲线，结果见图6。结果显示，线性方程为Y=7.357 8X+84.344 7，相关系数R2为0.999 3，槲皮素在10 ～250 ng·mL-1线性关系良好。

图6 标准曲线图

2.6 稳定性试验

取同一浓度标准溶液放置6 h、12 h、24 h、48 h后进样分析，发现样品的质量浓度无明显差异，精密度为0.5%，表明槲皮素在95%乙醇溶液中的稳定性良好，此方法可行。

2.7 加标回收率和精密度

用已知槲皮素浓度的洋葱进行3 个水平的加标回收试验，添加量分别为2.0 μg、6.0 μg、8.0 μg，每个添加水平重复3 次，按照样品分析方法进行回收试验。由表1 可知，平均回收率为92.0%～102.3%，RSD 为0.8%～3.1%。结果表明，此检验方法回收效果好，精密度高。

表1 槲皮素的回收率和精密度表（n=3）

2.8 检出限及定量限

本文以样品响应值为3 倍信噪比的添加浓度为方法检出限，以10 倍信噪比的添加浓度为方法定量限。因洋葱自身含有槲皮素，所以在确定检出限及定量限的样品中，本实验选择空白试剂代替洋葱样品。将标准溶液加入空白试剂中，按本实验的提取方法操作，经过多次实验，得到方法检出限为0.01 mg·kg-1，定量限为0.05 mg·kg-1。

2.9 洋葱样品测定

采用本实验方法对百色农贸市场随机抽取的50 份红皮洋葱进行分析，结果均检出槲皮素。洋葱不同部位的槲皮素含量有较大差别，洋葱表皮中槲皮素含量最高，为58.2 mg·kg-1；洋葱中部槲皮素含量为29.8 mg·kg-1；洋葱中心槲皮素含量较低，为15.4 mg·kg-1。

3 结论

本实验通过考察洋葱中槲皮素提取条件，得到最佳提取条件为提取溶剂95%乙醇、提取温度60 ℃、超声时间120 min，同时建立了液相色谱-串联质谱法测定红洋葱中槲皮素的分析方法。结果表明，该方法前处理简单、准确性和灵敏度高，所使用提取溶剂安全且可直接购买，适合红洋葱中槲皮素的日常检测。