SYNGR2影响猪圆环病毒2型体外增殖的研究

梁凯欣,钟海文,宋长绪,杨化强,黄思秀,徐 铮

(华南农业大学动物科学学院,国家生猪种业工程技术研究中心,广州 510642)

猪圆环病毒 2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是猪圆环病毒中常见且危害较大的致病亚型,因其传播性、变异性较强[1],目前PCV2及多个变种毒株在我国各地猪场广泛传播[2]。PCV2在感染过程中多与猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等其他病毒协同感染[3-5],引发仔猪断奶后多系统消耗综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的发生[6],并导致仔猪免疫抑制[7],给相关疾病的预防及治疗增添难度,且极大影响养殖效率及成本。PCV2主要通过和不同的宿主因子互作来完成自身生命周期[8-10]。因此,探究参与PCV2感染的关键宿主因子可以为病毒感染机制及抗病育种研究提供重要思路。

Synaptogyrin-2 (SYNGR2)被证实参与神经囊泡和微囊泡组成,在除脑以外组织中高表达。在果蝇体内,缺失SYNGR2会造成突触囊泡的发生受阻,在哺乳动物体内SYNGR2的详细功能仍然研究较少[11]。除神经囊泡外,SYNGR2还参与了葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter-4,GLUT4)的胞内循环,SYNGR2参与组成的囊泡可将质膜上的GLUT4转移至反面高尔基体管网状结构(trans Golgi network,TGN)或溶酶体[12]。在病毒感染方面,SYNGR2可通过与病毒蛋白、脂筏等宿主因子结合形成复合体的形式参与发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)的包涵体组成,协助病毒复制[13]。在细胞膨胀毒素(cytolethal distending toxin,Cdt)内化的过程中,SYNGR2也通过相似的方式与毒素活性亚基CdtB、脂筏结合。SYNGR2敲低的人巨噬细胞可抵御毒素引起的炎症反应[14]。

Walker等[15]基于样本量为974的猪群,通过全基因组关联分析揭示了SYNGR2可促进PCV2感染,并且发现了位于SYNGR2关键功能结构域中的唯一SNP位点,在此位点存在针对猪的物种特异抗性突变SYNGR2 p.Arg63Cys,个体的PCV2抗性跟该位点的基因型直接相关。作者通过构建系统进化树,对比国内外几种主要猪种的基因型与样本中包含该SNP的几种主要单倍型,发现在杜洛克等外来品种中SYNGR2 p.63Cys基因频率较高,且该抗性突变在我国本土品种中较少见,揭示SYNGR2可能成为我国PCV2抗性猪培育的切入点。

本研究首先在体外验证宿主因子SYNGR2及错义突变SYNGR2 p.Arg63Cys对PCV2在PK15细胞上增殖的影响,并通过转录组分析研究与SYNGR2功能相关的基因变化,寻找与SYNGR2关联的其他PCV2感染相关宿主因子,研究PCV2与宿主的相互作用,揭示PCV2感染宿主的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒及质粒

PK15细胞、PCV2毒株(PCV2-JS17-8,GenBank编号:MH211363.1)、pX330质粒为本实验室保存;两种SYNGR2过表达质粒(Arg型和Cys型)由本实验室构建并保存。

1.2 主要试剂

RaPure Viral RNA/DNA Kit购自美基生物公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、DNA Ligation Kit、PrimeScript RT Master Mix购自TaKaRa公司;2×Rapid Taq Master Mix购自诺唯赞公司;Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher公司。

1.3 SYNGR2敲除、过表达及点突变对PCV2增殖水平影响的鉴定

1.3.1 CRISPR/Cas9 技术构建SYNGR2基因敲除PK15细胞系 设计靶向SYNGR2外显子区域的gRNA,gRNA识别SYNGR2基因第2外显子上的靶位点序列:GTACTGCTCTCCGGACTTG。合成gRNA相应的Oligo DNA(合成序列见表1SYNGR2-exon2-gRNA-F和SYNGR2-exon2-gRNA-R所示),经过退火并连接入CRISPR打靶载体pX330,形成pX330-SYNGR2 gRNA质粒。将pX330-SYNGR2 gRNA质粒以电穿孔转染入PK15细胞,经过G418筛选获得稳定敲除SYNGR2的单克隆细胞。逐个挑取单克隆细胞,抽提基因组DNA后以PCR扩增SYNGR2打靶位点附近的基因组序列进行测序检测,CRISPR打靶位点处含有纯合移码突变的细胞克隆即为SYNGR2基因敲除(KO)细胞系。经过同样筛选过程但是目的位点未发生敲除的细胞用作野生型(WT)对照细胞。SYNGR2基因型鉴定引物见表1 SYNGR2-exon2-F和SYNGR2-exon2-R所示。

表1 本研究用到的引物和寡聚核苷酸序列Table 1 Primer and oligo sequences used in this study

1.3.2 SYNGR2蛋白表达分析 采用Western blot方法检测基因敲除细胞中SYNGR2蛋白的表达情况。WT和KO细胞以RIPA裂解液进行裂解,将等量细胞裂解液上样进行SDS-PAGE分离蛋白。电泳完毕后将蛋白进行转膜,并对蛋白膜进行封闭和SYNGR2一抗(Rabbit polyclonal to Synaptogyrin 2,ab106459,Abcam)孵育。此后对蛋白膜以TBST进行洗涤并继续孵育HRP标记的羊抗兔IgG二抗,洗涤后进行ECL曝光,获取目的蛋白信号。

1.3.3 SYNGR2过表达质粒转染PK15细胞 以PK15细胞的cDNA作为模版扩增SYNGR2编码区序列,并连接入pcDNA3.1载体构建SYNGR2过表达载体。转染前将PK15细胞铺于24孔板中,待第2天细胞长满后进行转染。转染方法按照Lipofectamine 3000说明书步骤进行。

1.3.4 SYNGR2突变体PK15细胞筛选 PK15细胞系为SYNGR2 p.63Arg基因型,为了获取SYNGR2 p.63Cys型PK15,采用CRISPR介导的同源重组方案进行目的位点突变操作。作者设计了覆盖突变位点处的200 bp的单链DNA作为同源修复模板,并将模板中的编码SYNGR2 p.63Arg的核苷酸突变为TGC(对应氨基酸为Cys)。将单链模板和pX330-SYNGR2 gRNA质粒共转染PK15细胞,进行G418筛选,获得单克隆细胞。逐个挑取单克隆细胞,抽提基因组DNA后以PCR扩增SYNGR2打靶位点附近的基因组序列进行测序检测,目的位点处含有纯合T/T或杂合T/C的细胞系为阳性突变细胞系。

1.3.5 PCV2感染PK15细胞 细胞以2×105·mL-1密度铺板后24 h内,将PCV2储存液以DMEM进行稀释后,以MOI=1的剂量进行细胞感染。病毒于37 ℃吸附2 h后换DMEM继续培养,在对应时间点收集细胞和上清,冻融2次后释放病毒,抽提病毒DNA进行定量检测。病毒增殖情况,通过qPCR结合标准曲线计算病毒拷贝数或通过2-ΔΔCt法计算相对病毒量。病毒生长曲线需分别收获感染后0、12、24、48、72 h各时间点细胞及上清样品,通过qPCR计算病毒拷贝数。qPCR所用引物和探针见表1。qPCR体系包括Probe qPCR Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,探针0.2 μL,病毒DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL。反应程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环。

1.4 SYNGR2 KO PK15细胞及野生型细胞转录组测序

1.4.1 原始数据过滤及质量评估 对测序所得的reads采用Cutadapt去除3′端带接头的序列,并去除平均质量分数低于Q20的reads。利用单碱基质量分布图、碱基含量分布、reads平均质量分布来评估测序质量。

1.4.2 基因组比对及基因表达差异分析 利用HISAT2将reads比对到参考基因组上。将统计到成功比对到各基因的read count作为各基因的原始表达量,采用DESeq对基因表达量进行差异分析,分析标准为P-value <0.05,log2(Fold Change)>1。

1.4.3 基因表达模式聚类分析 对各组样品中差异表达基因的表达量通过取log2(FPKM+1)的方式标准化,再通过计算Zscore对不同样品同一基因表达量进行标准化,将标准化后的基因表达量代入ORIGIN 2021软件绘制聚类热图。

1.4.4 GO富集分析及KEGG通路分析 使用TopGO进行GO富集分析,通过计算P-value筛选差异基因显著富集的GO term;对差异表达基因进行KEGG富集分析,通过计算FDR值筛选被显著富集到的通路。

1.5 PK15细胞中MYRIP、RAB27A、RAB27B等宿主因子mRNA表达量检测

提取细胞中的总RNA,根据各样品中RNA浓度适当稀释后,用反转录试剂盒去除样品中的DNA并将mRNA反转录为cDNA。将得到的cDNA产物稀释10倍后作为RT-qPCR模板,利用SYBR法进行定量PCR扩增和检测,根据2-ΔΔCt方法计算得到相对定量结果。qPCR所用引物和探针见表1。qPCR体系包括SYBR Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 7.2 μL。反应程序:95 ℃预变性 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,40个循环;熔解曲线反应条件为95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min。

1.6 不同品种猪群中SYNGR2等位基因频率分析

基于29个猪种全基因组测序数据,针对突变SYNGR2 p.Arg63Cys发生的SNP位点进行序列比对,统计该SNP位点中各等位基因出现的次数并计算相应的等位基因频率。

1.7 数据统计分析

本研究采用GraphPad Prism 9的Ttest及one-way ANOVA进行差异显著分析,ns表示P>0.05,差异不显著;*、**、***、****分别表示P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1,代表差异显著。

2 结 果

2.1 不同猪群中SYNGR2等位基因频率分析

针对国内外不同品种猪的群体遗传学分析表明,在杜洛克、大白猪等外来品种猪群中SYNGR2 p.Arg63Cys突变发生频率较高,而在国内大部分猪群中未检测到这一突变(表2),此结果与之前的研究相符[15]。

表2 不同猪群中SYNGR2的等位基因频率Table 2 Summary of allele frequencies of SYNGR2 in different pig breeds

2.2 敲除SYNGR2抑制PCV2体外增殖

将构建的靶向SYNGR2第2外显子区域的CRISPR/Cas9打靶质粒电转PK15细胞,筛选SYNGR2基因敲除的单克隆。以打靶位点处含有双等位移码突变的细胞作为阳性克隆,并通过Western blot检测SYNGR2蛋白的表达情况(图1A)。SYNGR2基因敲除细胞标记为SYNGR2 KO细胞,同时将经过同样筛选的野生型细胞(WT)用作对照。PCV2以MOI=1感染KO细胞和对照WT细胞,感染后48 h,冻融细胞释放病毒,通过qPCR检测病毒拷贝数。结果显示,WT组增殖的病毒量显著高于SYNGR2 KO组细胞(图1B)。

A. 基因敲除PK15细胞的SYNGR2蛋白表达分析,红色星号表示目的蛋白条带;B. PCV2感染野生型和SYNGR2基因敲除型PK15细胞48 h的病毒拷贝数;C、D. PCV2在野生型和SYNGR2基因敲除型PK15细胞上的生长曲线(C图为细胞上清中病毒,D图为胞内病毒)。*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;****. P<0.000 1A. Western blot assay of SYNGR2 expression in gene KO cells, SYNGR2 protein signal is denoted by red asterisk; B. PCV2 viral copies in WT and SYNGR2-KO PK15 cells infected with PCV2 for 48 h; C, D. Growth curves of PCV2 in WT and SYNGR2-KO PK15 cells (Fig.C shows the viral growth level in supernantant of infected cells, and Fig.D shows the viral growth level within cells). *. P<0.05;**. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1图1 PCV2在SYNGR2敲除PK15细胞上的增殖情况Fig.1 PCV2 proliferation level on SYNGR2 KO PK15

进一步对各时间点细胞与上清病毒拷贝数定量,绘制生长曲线,对比发现,SYNGR2 KO细胞中上清及细胞内PCV2病毒量在感染后第48、72小时低于WT组(图1C)。以上结果表明SYNGR2基因敲除可抑制PCV2在PK15上的增殖。

2.3 过表达SYNGR2补偿PCV2在SYNGR2敲除细胞上的增殖能力

将构建好的SYNGR2过表达质粒通过脂质体分别瞬时转染SYNGR2敲除细胞及野生型细胞,定量PCR结果检测显示过表达Arg和Cys型SYNGR2比野生型细胞的SYNGR2 mRNA水平高30倍左右(图2A)。SYNGR2敲除细胞转染后以MOI=1接种PCV2,过表达SYNGR2补偿PCV2在SYNGR2敲除细胞上的增殖能力(图2C),证明SYNGR2敲除是PCV2增殖受阻的影响因素。野生型细胞过表达SYNGR2后以MOI=1接种PCV2,对比未处理的野生型细胞,感染PCV2 48 h后,PCV2病毒含量无显著差异(图2B)。以上结果证实SYNGR2敲除抑制PCV2体外增殖,在敲除细胞上进一步补偿SYNGR2可以增加PCV2的复制能力。但是在野生型细胞过表达SYNGR2无法显著促进PCV2体外增殖,原因可能是SYNGR2在细胞正常生理状态下高表达,因此过表达后表型差异不显著。

A. SYNGR2过表达后的SYNGR2 mRNA水平分析;B. 野生型PK15过表达Arg和Cys型SYNGR2后对PCV2复制水平的影响;C. SYNGR2敲除的PK15细胞过表达Arg和Cys型SYNGR2后对PCV2复制水平的影响。**. P <0.01;***. P <0.001;****. P <0.000 1A. Determination of SYNGR2 mRNA levels after overexpression of SYNGR2 in PK15 cells; B. PCV2 viral copies in WT PK15 transfected with SYNGR2-Arg and SYNGR2-Cys expressing plasmids and infected with PCV2 for 48 h; C. PCV2 viral copies in SYNGR2-KO PK15 transfected with SYNGR2-Arg and SYNGR2-Cys expressing plasmids and infected with PCV2 for 48 h. **. P <0.01; ***. P <0.001; ****. P <0.000 1图2 SYNGR2敲除细胞及野生型细胞过表达不同基因型SYNGR2后PCV2的增殖情况Fig.2 PCV2 proliferation on WT PK15 or SYNGR2 KO PK15 over-expressing SYNGR2 with different genotypes

2.4 SYNGR2 p.Arg63Cys点突变降低PCV2体外增殖能力

PK15细胞的SYNGR2为Arg基因型,为了检测Arg和Cys两种基因型对PCV2复制能力的影响,作者对PK15细胞进行点突变,获得SYNGR2-Cys型的PK15细胞。PCV2感染SYNGR2野生型(SYNGR2-Arg)及构建好的突变PK15细胞(SYNGR2-Cys)。与野生型细胞相比,感染48 h后突变PK15细胞上的病毒含量显著降低(P<0.01)(图3A)。细胞及上清内的PCV2生长曲线趋势也表明SYNGR2-Cys型细胞中PCV2增殖较SYNGR2-Arg型细胞差(图3B)。以上结果说明SYNGR2 p.Arg63Cys突变后可提高PK15细胞对PCV2的抗性。

A. PCV2感染野生型和SYNGR2 p.Arg63Cys突变型PK15细胞48 h的病毒拷贝数;B、C. PCV2在野生型和SYNGR2 p.Arg63Cys突变型PK15细胞上的生长曲线(B图为细胞上清中病毒,C图为胞内病毒)。**. P <0.01;***. P <0.001A. PCV2 viral copies in WT and SYNGR2 p.Arg63Cys mutant PK15 cells infected with PCV2 for 48 h; B,C. Growth curves of PCV2 in WT and SYNGR2 p.Arg63Cys mutant PK15 cells (Fig.B shows the viral growth level in supernantant of infected cells and shows the viral growth level within cells). **. P <0.01; ***. P <0.001图3 PCV2在SYNGR2 p.Arg63Cys点突变PK15细胞上的增殖情况Fig.3 PCV2 replication level in PK15 with SYNGR2 p.Arg63Cys mutation

2.5 SYNGR2基因敲除细胞的转录组分析

为了探究SYNGR2在PCV2感染中的功能,对SYNGR2敲除细胞及野生型细胞进行转录组水平高通量测序。每组分别检测3株KO或WT型细胞,平均每个样品测得reads数约为440 000,其中绝大部分reads被正确识别(>99.9%),说明测序质量良好。对RNAseq数据进行质控筛选后,将筛选后数据以NCBI的Sscrofa11.1为参考基因组进行比对,平均94%左右的clean reads被成功匹配到特定基因。以P-value<0.05,log2(Fold Change)>1为表达量差异显著条件筛选匹配到的基因。结果显示,SYNGR2敲除后,共有176个基因表达量显著上调,85个基因表达量显著下调(图4A、B)。

A. 火山图展示SYNGR2野生型和敲除型PK15细胞差异表达基因的分布;B. SYNGR2野生型和敲除型PK15细胞上上调和下调差异表达基因数A. Volcano plot showing distribution of differentially expressed genes between WT and KO cells; B. The numbers of differentially expressed genes with up-regulation and down-regulation between WT and KO cells图4 SYNGR2基因敲除与野生型PK15细胞的差异表达基因分析Fig.4 Differentially expressed gene analysis between SYNGR2-KO and WT PK15 cells

对所有差异表达基因进行GO和KEGG通路富集分析,筛选富集到SYNGR2的通路,统计这些通路中包含的差异表达基因(DEG)并进一步分析。筛选共得到196个与SYNGR2功能相关的差异表达基因,包括细胞免疫相关的防御素β1(defensin beta 1,DEFB1)、参与组成胞吐囊泡的MYRIP及抗原呈递相关的猪白细胞抗原Ⅱ型(swine leukocyte antigen-Ⅱ,SLAⅡ)基因等。196个SYNGR2功能相关差异表达基因在两组细胞中的差异情况如图5所示。其中最显著上调和下调的10个基因信息见表3所示。进一步的GO富集分析结果显示,差异表达基因与膜成分、囊泡组成及被膜细胞器组成等密切相关(图6A、B),揭示SYNGR2在细胞中的主要功能为参与组成膜成分组成及相关囊泡运输。

图5 SYNGR2功能相关差异表达基因聚类热图Fig.5 Clustering heat map of SYNGR2-related differentially expressed genes

A. SYNGR2功能相关差异表达基因GO分析条形图;B. SYNGR2功能相关差异表达基因GO分析饼图A. Bar plot for GO analysis of SYNGR2 associated DEGs; B. Pie chart for GO analysis of SYNGR2 associated DEGs图6 SYNGR2功能相关差异表达基因GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes functionally related to SYNGR2

表3 前10名显著上调差异表达基因及前10名显著下调差异表达基因Table 3 The top 10 DEGs for upregulation and downregulation between SYNGR2 KO and WT cells

2.6 SYNGR2基因敲除影响囊泡相关蛋白RAB27A的转录

作者对富集到囊泡相关功能的宿主因子MYRIP进一步研究。由于MYRIP在PK15细胞中表达丰度过低,无法通过qPCR检测其mRNA表达量。MYRIP是RAB27特异的结合蛋白,通过qPCR检测两种细胞中RAB27A、RAB27B的mRNA表达量,结果显示,RAB27A在SYNGR2敲除后,mRNA表达量提升约1.4倍(图7)。

****. P<0.0001图7 SYNGR2基因敲除细胞及野生型细胞中RAB27A mRNA的表达差异Fig.7 Differential expression levels of RAB27A mRNA between SYNGR2-KO and WT PK15

为了探究RAB27A与PCV2感染之间的关系,作者比较了PCV2感染及未感染情况下细胞中RAB27A表达量,结果显示PCV2感染对细胞内RAB27A mRNA表达量没有显著影响。对PCV2感染及未感染细胞中的SYNGR2 mRNA表达量进行检测,二者差异也不显著(结果未展示)。

3 讨 论

SYNGR2是四跨膜蛋白超家族(tetraspanins,tspans)成员,tspan蛋白可通过在细胞膜上聚集形成tspan富集的微结构域(tspan-enriched microdomains,TEM),召集受体等功能蛋白至TEM后,tspan通过结合不同功能蛋白,可参与病毒感染吸附[16]、内化[17]、胞内运输[18]、病毒复制[19]、胞间运输等感染阶段[20]。SYNGR2可通过与病毒蛋白及其他宿主因子结合参与病毒感染[13],但SYNGR2的具体功能及作用机制仍未知。已有研究报道SYNGR2与PCV2引起的病毒血症相关,且SYNGR2点突变导致了可抑制体内PCV2病毒载量增加的抗性突变体产生[15]。由于SYNGR2参与组成的微囊泡在多种细胞类型中普遍存在[21],结合上述研究,推测SYNGR2可能通过形成包裹病毒蛋白的病毒囊泡来协助PCV2等病毒感染。

本研究首先通过对PK15细胞中SYNGR2进行敲除、回补、定点突变验证了SYNGR2对PCV2体外增殖的影响。试验结果表明,敲除SYNGR2后攻毒,感染后48 h病毒拷贝数显著低于相同处理的野生型细胞,感染后0～72 h内生长曲线反映了相同趋势;对敲除SYNGR2的细胞过表达SYNGR2回补后发现,病毒拷贝数显著提高,证实SYNGR2是PCV2拷贝数变化的因素之一。对Arg/Cys定点突变型细胞进行PCV2感染,感染后48 h病毒拷贝数显示Cys型细胞抗性较Arg型细胞强。以上结果说明SYNGR2可促进PCV2体外增殖,并且突变SYNGR2 p.Arg63Cys发生位点是在SYNGR2参与PCV2感染过程中发挥主要作用的关键SNP位点。

本研究通过分析SYNGR2 KO细胞及WT型细胞的RNA-seq数据,根据富集分析结果进一步筛选与SYNGR2相关数据进行后续研究发现,SYNGR2主要参与膜成分、囊泡等被膜细胞器组成,由差异表达基因MYRIP调节的外泌体分泌相关基因RAB27A[22]mRNA表达量在SYNGR2敲除或PCV2感染条件下显著提高。研究报道,在SYNGR2敲除或者发生SYNGR2 p.63Cys点突变后,细胞内外PCV2拷贝数之比明显减小,研究者猜测这是由于PCV2内化或者胞内运输受阻导致。由于PCV2感染的PK15细胞可分泌包含PCV2的外泌体[23],结合RAB27A参与组成的外泌体可协助塞内卡病毒(Seneca Valley virus, SVV)[24]、PRRSV[25]、甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)和丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV)[26]内化及免疫逃逸,作者推测RAB27A和SYNGR2可以通过组成囊泡参与PCV2运输协助其体外感染PK15,这也可以解释为何SYNGR2敲除后,PCV2内化、胞内运输受阻,但仍有部分病毒可以正常增殖[27]。RAB27A在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)感染过程中与病毒蛋白共定位于囊泡,且RAB27A敲降可显著抑制HSV-1感染,但qPCR及免疫荧光均未检测到感染期间RAB27A表达量变化[28]。本研究同样未能检测到PCV2感染对SYNGR2及RAB27A表达的影响,其潜在机制可能与PCV2与宿主因子的互作模式相关,病毒蛋白可诱导宿主因子转移至病毒囊泡内,从而挟持宿主因子参与自身感染,但此过程不一定涉及宿主因子表达水平的改变,SYNGR2及RAB27A参与PCV2感染的具体机制还有待进一步研究。

4 结 论

SYNGR2是支持PCV2在PK15细胞增殖的关键宿主因子,缺失SYNGR2显著影响PCV2的体外增殖。通过对SYNGR2 敲除细胞及野生型细胞进行转录组测序及差异表达基因分析、富集分析,本研究揭示了SYGNR2及RAB27A在PCV2感染过程中潜在的功能。