解淀粉芽孢杆菌固态发酵对全棉籽营养价值和体外发酵特性的影响

黎光杨 王之盛* 胡 瑞 邹华围 姜雅慧 代秦丹 梁秀容 张祺琪 王艳阳 彭全辉 周振勇 张 杨 朱兵山

(1.四川农业大学动物营养研究所,肉用牛低碳养殖创新团队,四川省牛低碳养殖与安全生产高校重点实验室,成都 611130;2.新疆畜牧科学院畜牧研究所,乌鲁木齐 830000;3.新疆刀郎阳光农牧科技股份有限公司,喀什 844000)

随着我国畜牧养殖产业快速发展,优质蛋白质饲料原料的匮乏成为我国饲料行业面临的主要问题。此外,随着玉米、豆粕减量替代计划推出,传统玉米-豆粕型饲粮结构逐步发生变化,多元化饲料配方将成为我国畜牧养殖业的常态。因此,开发新的饲料原料和充分利用现有饲料原料是行业发展的重要目标。

我国是产棉大国,棉花加工副产物全棉籽(whole cottonseed,WCS)产量丰富。全棉籽既能提供能量和蛋白质,又能提供有效纤维,是极具潜力的反刍动物饲料原料[1]。但由于存在游离棉酚等抗营养因子、蛋白质品质不高、消化利用率低等问题,使得全棉籽的饲料化利用存在一定限制[2-3]。微生物固态发酵是改善饲料原料品质的有效手段[4]。Sun等[5]通过固态发酵棉籽粕、代秦丹等[6]通过固态发酵酒糟发现,发酵后棉籽粕和酒糟营养价值得到显著改善。因此,本试验以解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)作为发酵菌种,固态发酵全棉籽,结合单因素试验和正交试验筛选出全棉籽适宜的发酵条件,评估发酵效果和营养价值,以期为全棉籽的饲料资源化高效利用提供试验数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵菌种:解淀粉芽孢杆菌T11(BacillusamyloliquefaciensT11)为四川农业大学动物营养研究所草食动物营养研究室筛选保藏的菌株,保藏号为CCTCC M 20211450,保藏地为中国典型培养物保藏中心(湖北武汉)。

发酵底物:全棉籽、玉米面和麦麸按8∶1∶1比例混匀作为发酵底物。全棉籽采自新疆喀什,粗蛋白质含量为25.56%;玉米面和麦麸采自四川农业大学动物营养研究所教学科研基地,粗蛋白质含量分别为7.61%和15.66%。称取20 g发酵底物,装入250 mL三角瓶中,按照设定的试验条件进行固态发酵。

1.2 种子液的制备

将保藏的解淀粉芽孢杆菌T11菌液接种到鉴别培养基上培养48 h,挑取1接种环的菌株接种到装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中,于39 ℃、180 r/min条件下振荡培养16 h,作为种子液[6]。此菌液浓度下进行平板计数,测得其浓度约为2.03×107CFU/mL。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验

采用单因素试验设计对发酵因素初步优化,发酵因素分别为发酵温度(30、33、36、39和42 ℃;此时固定发酵时间4 d,接种量20%,料水比1∶0.8)、发酵时间(2、3、4、5和6 d;此时固定发酵温度39 ℃,接种量20%,料水比1∶0.8)、接种量(10%、15%、20%、25%和30%,体积质量比,即v/m;此时固定发酵温度39 ℃,发酵时间5 d,料水比1∶0.8)、料水比(1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0和1∶1.2;此时固定发酵温度39℃,发酵时间5 d,接种量25%),每个处理3个重复。发酵结束后测定粗蛋白质含量。

1.3.2 正交试验

采用正交试验进一步对发酵温度(A)、发酵时间(B)、接种量(C)、料水比(D)进行4因素3水平条件优化,每个处理3个重复。发酵结束后测定粗蛋白质含量。根据极差分析和方差分析得到最优发酵条件。

1.3.3 体外发酵试验

晨饲前2 h采集3头体况良好的黄牛瘤胃液,混匀后过滤到充满二氧化碳(CO2)且预热至39 ℃的密封保温瓶中,并立即运回实验室。黄牛饲养于四川农业大学动物营养研究所试验基地。

参照Menke等[7]方法配制人工瘤胃液并进行体外发酵。设置对照组(以未发酵全棉籽为底物)和发酵组(以发酵全棉籽为底物,该发酵全棉籽是由正交试验得到的适宜条件经解淀粉芽孢杆菌固态发酵获得),并设未添加任何底物的空白对照,用于矫正累积产气量。在发酵3、6、9、12、24、48 h时记录产气量;在发酵12、24、48 h时收集发酵液,测定pH后,分装发酵液用于发酵参数的测定。

1.4 指标测定与计算

干物质(DM)、粗灰分(Ash)、粗纤维(CF)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗蛋白质(CP)含量分别按照GB/T 6435—2014、GB/T 6438—2007、GB/T 6434—2006、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2022、GB/T 6432—2018中方法测定;样品经硫酸铜沉淀法预处理后参照文献[8]的方法测定真蛋白质(TP)含量;氨基酸含量的测定参照GB/T 18246—2019;游离棉酚含量的测定参照GB/T 13086—2020;黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的测定参照NY/T 2071—2011,脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的测定参照GB/T 30956—2014;淀粉酶和纤维素酶活性采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定;蛋白酶活性参照SB/T 10317—1999中的福林法测定。利用扫描电镜(HITACHI Regulus 8100)进行表面结构观察。

采用雷磁25型pH计测定发酵液pH。采用碱性次氯酸钠-苯酚分光光度法[9]进行氨态氮(NH3-N)浓度测定。使用差速离心法[10]提取微生物蛋白(MCP)沉淀,稀释后使用BCA蛋白定量测试盒(南京建成生物工程研究所)测定MCP浓度。采用气相色谱仪(CP-3800)测定乙酸、丙酸和丁酸浓度,计算乙酸/丙酸的值,总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度为乙酸、丙酸和丁酸浓度之和。

产气量的计算公式[11]为:

GPt=200×(Vt-V0)/W。

式中:GPt为样品在t时刻的产气量(mL/mg);Vt为样品发酵t小时后发酵管刻度读数;V0为样品在开始发酵时空白发酵管刻度读数;W为样品干物质重量(mg)。

对产气量进行非线性拟合,计算公式[12]为:

GPt=a+b×(1-e-ct)。

式中:GPt为t时刻的产气量(mL/mg);a为快速发酵部分产气量(mL/mg);b为慢速发酵部分产气量;c为慢速发酵部分的产气速率(%/h);a+b为潜在产气量(mL/mg);t为发酵时间(h)。

1.5 数据统计与分析

试验数据经Excel 2019整理后,采用SPSS 27.0对单因素试验结果进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并使用Duncan氏法进行多重比较,并以粗蛋白质含量增加率作为效应指标进行二次回归统计分析;对正交试验结果进行极差和方差分析;对发酵前后全棉籽的营养成分含量和体外瘤胃发酵参数进行独立样本t检验。结果均用平均值±标准误表示,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同发酵条件下解淀粉芽孢杆菌固态发酵对全棉籽粗蛋白质含量的影响

2.1.1 单因素试验结果

解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽单因素试验结果如图1所示。随着发酵温度的升高,粗蛋白质含量先上升后下降,当发酵温度为36和39 ℃时,粗蛋白质含量接近且显著高于其余发酵温度时(P<0.05)。随着发酵时间的增加,粗蛋白质含量先升高后趋于稳定,发酵4 d及以后时粗蛋白质含量显著高于其余发酵时间时(P<0.05)。随着接种量的增加,粗蛋白质含量先升高后下降,当接种量为25%时,粗蛋白质含量显著高于其余接种量(P<0.05)。随着料水比的降低,粗蛋白质含量先上升后下降,当料水比为1∶0.6时,粗蛋白质含量最高且显著高于其余料水比时(P<0.05)。根据单因素试验的回归分析(表1),可以确定当发酵温度为38.24 ℃,发酵时间为5.03 d,接种量为24.17%,含水量为36.50%(料水比1∶0.6)时,粗蛋白质含量最高。根据单因素试验结果,确定正交试验选取的4个因素的3个水平分别为:发酵温度,36、39、42 ℃;发酵时间,4、5、6 d;接种量,20%、25%、30%;料水比,1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8。

2.1.2 正交试验结果

由极差分析(表2)的R值和方差分析(表3)的F值可知,影响解淀粉芽孢杆菌固体发酵全棉籽的因素先后顺序为发酵时间、料水比、发酵温度和接种量。方差分析结果表明发酵温度、发酵时间、接种量及料水比均显著影响粗蛋白质含量增加率(P<0.05)。根据极差分析(表2)的K值可得最佳发酵组合为:发酵温度42 ℃,发酵时间6 d,接种量20%,料水比1∶0.6。

表1 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽单因素试验结果的回归分析

表2 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽正交试验结果的极差分析

表3 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽正交试验结果的方差分析

2.2 适宜条件下解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽后营养价值的变化

2.2.1 发酵前后常规营养成分含量的变化

由表4可知,在正交试验得出的适宜条件下对全棉籽进行发酵,与发酵前相比,全棉籽发酵后粗蛋白质含量从21.35%提高到25.73%(P<0.05),真蛋白质含量从20.24%提高到22.50%(P<0.05),中性洗涤纤维含量变化不显著(P>0.05),酸性洗涤纤维含量从28.37%降低到27.80%(P<0.05),粗纤维含量从24.96%降低到22.95%(P<0.05),粗灰分含量从4.01%提高到5.27%(P<0.05)。

表4 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽前后常规营养成分含量对比(干物质基础)

2.2.2 发酵前后氨基酸含量的变化

由表5可知,与发酵前相比,全棉籽发酵后谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸含量没有显著变化(P>0.05),脯氨酸含量显著降低(P<0.05),其他氨基酸含量均显著提高(P<0.05);此外,必需氨基酸含量从5.98%提高到6.86%(P<0.05),提高了14.72%;总氨基酸含量从20.20%提高到21.66%(P<0.05),提高了7.23%。

表5 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽前后氨基酸含量对比(干物质基础)

2.2.3 发酵前后游离棉酚和霉菌毒素含量的变化

由表6可知,与发酵前相比,全棉籽发酵后游离棉酚含量从3 316.60 mg/kg降低到1 444.40 mg/kg(P<0.05),降低了56.45%;玉米赤霉烯酮含量没有显著变化(P>0.05),脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量从0.13 mg/kg降低到0.10 mg/kg(P<0.05)。全棉籽在发酵前和发酵后均未检出黄曲霉毒素B1。

表6 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽前后游离棉酚和霉菌毒素含量对比(干物质基础)

2.2.4 发酵前后酶活性的变化

由表7可知,与发酵前相比,全棉籽发酵后淀粉酶活性由0.00 U/g达到34.67 U/g(P<0.05),纤维素酶活性由251.12 U/g提高到364.13 U/g(P<0.05),中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活性显著提高(P<0.05),分别提高了171.66%、100.58%和129.11%。

表7 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽前后酶活性对比

2.2.5 发酵前后超微结构的变化

由扫描电镜图(图2)可知,发酵前的全棉籽的结构较完整,表面光滑;发酵后的全棉籽表面不平整,有很多不规则孔洞,纤维结构被破坏,结构较松散。

2.3 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽对体外发酵特性的影响

2.3.1 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽对体外发酵产气量和产气参数的影响

由图3可知,随体外发酵时间的延长,对照组和发酵组的产气量均呈增加趋势。由表8可知,发酵不同时间(12、24和48 h)时对照组的产气量均显著高于发酵组(P<0.05);对照组的快速发酵部分产气量和潜在产气量显著高于发酵组(P<0.05),慢速发酵部分产气量和产气速率显著低于发酵组(P<0.05)。

2.3.2 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽对体外发酵参数的影响

由表9可知,对照组与发酵组的pH无显著差异(P>0.05);发酵组体外发酵24和48 h时NH3-N浓度显著高于对照组(P<0.05),体外发酵12 h时NH3-N浓度与对照组无显著差异(P>0.05);发酵组体外发酵12 h时MCP浓度显著高于对照组(P<0.05),体外发酵24和48 h时MCP浓度与对照组无显著差异(P>0.05);发酵组体外发酵12、24和48 h时TVFA、乙酸浓度显著高于对照组(P<0.05),体外发酵24和48 h时丁酸浓度显著高于对照组(P<0.05);体外发酵12、24和48 h时,发酵组与对照组的丙酸浓度和乙酸/丙酸的值没有显著差异(P>0.05)。

A、B为发酵前的全棉籽,C、D为发酵后的全棉籽。A和C的放大倍数为1 000倍,B和D的放大倍数为3 000倍。

图3 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽体外发酵产气量动态变化

3 讨 论

3.1 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽条件优化

发酵温度、发酵时间、料水比和接种量是影响发酵效果的主要因素[13]。本试验中,发酵时间和料水比对发酵效果影响较大,其次是发酵温度和接种量。发酵时间通过影响菌株的数量和产酶量间接影响发酵效果。料水比即含水量直接影响菌株的生存环境和活性,进而影响产酶效果[14]。

表8 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽对体外发酵产气量和产气参数的影响

刘倚帆等[15]在发酵全棉籽时将含水量控制在30%,与本试验中所得最适料水比相差不大。微生物的生长会因为过高或过低的温度受到限制,菌株生长的适宜温度决定了固态发酵工艺的温度。Gao等[16]筛选的芽孢杆菌发酵豆粕的最适温度为40 ℃,与本研究的得出的最适发酵温度相近。接种量的大小直接决定发酵质量,过低导致产酶活力受限,易被杂菌污染;过高导致微生物过度繁殖使发酵效果不佳。韦涛等[17]利用纳豆芽孢杆菌发酵小米糠的研究结果表明,随着接种量的增加,发酵效果先升高后降低,与本试验中接种量对全棉籽粗蛋白质含量的影响结果一致。

表9 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽对体外发酵参数的影响

3.2 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽的效果

微生物固态发酵是改善饲料原料营养价值的有效途径。夏新成等[18]利用酵母和霉菌复合发酵棉籽粕,使其粗蛋白质含量提高了17.72%。本试验中,全棉籽经解淀粉芽孢杆菌固态发酵后粗蛋白质含量提高了20.52%,这可能是发酵过程中微生物合成MCP,同时消耗碳水化合物,造成部分干物质损失,从而提高了粗蛋白质含量。此外,微生物将非蛋白氮转化为真蛋白氮,使全棉籽的真蛋白质含量提高,与李英英等[19]的研究结果一致。发酵后全棉籽的纤维含量降低,这与Sun等[5]研究结果一致,可能是微生物产生纤维素酶,起到降解纤维作用。同时,扫描电镜结果表明发酵后全棉籽的结构疏松多孔,更有利于动物消化吸收。发酵后,全棉籽的粗灰分含量升高了31.42%,这是因为微生物利用了底物中的有机物,间接导致粗灰分含量上升,与Chi等[20]发酵豆粕所得结果一致。王晓玲等[21]利用混菌发酵棉籽粕,发酵后总氨基酸和必需氨基酸含量分别增加了22.20%和28.40%。本试验中,发酵后全棉籽的必需氨基酸和总氨基酸含量分别提高了14.72%和7.23%,但增幅与王晓玲等[21]的研究结果存在差距。这可能是因为发酵底物不同,且单菌发酵效果不及混菌发酵;此外,微生物利用氨基酸存在偏好,直接影响发酵后的氨基酸含量变化[4]。

微生物发酵会产生多种酶类,不同微生物的产酶特性不同。和小黑[22]研究发现,枯草芽孢杆菌发酵棉籽粕产物中含有丰富的淀粉酶和蛋白酶。本试验中,发酵后全棉籽的淀粉酶活性达到34.67 U/g,发酵过程中可将淀粉降解为单糖等供微生物生长繁殖,合成MCP;纤维素酶活性提高了45.00%,说明发酵破坏底物纤维结构,使粗纤维含量显著降低;中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活性均显著提高,使不易被消化吸收的大分子蛋白质降解为易被利用的小分子多肽类物质,使植物蛋白转化为更优质的MCP。

固态发酵能有效降低饲料中抗营养因子的含量。张文举等[23]用热带假丝酵母、黑曲霉以及复合菌固态发酵棉籽粕,使得游离棉酚含量显著下降,与本试验结果一致。Nagalakshmi等[24]认为发酵过程中游离棉酚与微生物分泌的氨基酸或者活性蛋白质中的游离氨基酸结合,形成结合棉酚;或者微生物能够分泌可降解棉酚的酶类,从而达到脱毒效果。霉菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中产生的次级代谢产物,通过影响动物的各种生理特性发挥毒性,含量超标会导致家畜的生产性能下降,甚至发生中毒。万里等[25]通过复合益生菌发酵饲料,使得黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量显著降低。《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇给出的限量分别是30.00 μg/kg、1 000 μg/kg和5.00 mg/kg。本试验中,发酵后全棉籽中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量降低了23.08%,与前人研究一致,玉米赤霉烯酮含量虽没有显著变化,但远低于《饲料卫生标准》的限量。

3.3 体外产气法评定发酵全棉籽的瘤胃发酵特性

产气参数反映瘤胃微生物对饲料中不同成分的发酵效果[26]。本试验中,发酵组的慢速发酵部分产气量和产气速率高于对照组,说明发酵后的全棉籽可一定程度提高瘤胃微生物的发酵能力,增强对非可溶性成分的消化。NH3-N浓度可以用来评定瘤胃微生物降解蛋白质与合成MCP的动态平衡情况。瘤胃液NH3-N浓度与饲料粗蛋白质含量呈正相关关系[27]。本试验中,发酵组的底物粗蛋白质含量高于对照组,所以发酵组的NH3-N浓度显著高于对照组。MCP作为反刍动物最主要的氮源,能够提供所需蛋白质的40%～80%,其浓度高低与微生物对NH3-N的利用效率有关。本试验中,体外发酵12 h时,发酵组MCP浓度显著高于对照组,可能是因为在发酵前期,底物碳水化合物含量较高,发酵组粗蛋白质含量更高,碳氮协同释放,转换效率更高,合成更多的MCP,这与Nocek等[28]的研究结果相同。挥发性脂肪酸是饲料中碳水化合物经瘤胃微生物发酵后的主要产物,是反刍动物生长和生产的主要能量来源[29]。体外发酵24和48 h时,发酵组的乙酸、丁酸和TVFA浓度均高于对照组,可能因为对照组结构性碳水化合物含量高,纤维降解菌不能充分利用,而发酵全棉籽非结构性碳水化合物含量较高,可消化养分增加,因此产生更多的挥发性脂肪酸[6]。

4 结 论

① 解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽的适宜条件为:发酵温度42 ℃,发酵时间6 d,接种量20%,料水比1∶0.6。

② 全棉籽经解淀粉芽孢杆菌固态发酵后,粗蛋白质含量由21.35%提高到25.73%,粗纤维含量由24.96%降低到22.95%,必需氨基酸含量由5.98%提高到6.86%,游离棉酚含量由3 316.60 mg/kg降低到1 444.40 mg/kg,霉菌毒素含量降低,淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶活性增加,营养价值得到有效改善。

③ 发酵全棉籽可提高体外发酵乙酸、丁酸和TVFA浓度,促进体外瘤胃发酵。