3种中药提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩的影响

谌琴丽,徐 剑,潘凯进,程震勇*

(1.湖北理工学院 医学院,湖北 黄石 435003;2.劲牌有限公司 劲牌研究院,湖北 黄石 435100)

山楂、桑叶[1-3]、甘草的中药提取物均具有药食同源的性质,具有抗氧化、降血脂的功效,常被加入到白酒中作为功效成分。但是,关于这3种中药提取物对肠道收缩舒张的调节作用的研究甚少。鉴于此,将家兔作为研究对象,选取其十二指肠开展离体小肠平滑肌实验,探究3种中药提取物对肠道收缩舒张的影响,旨在为合理搭配加入白酒的中药提取物提供实验资料。

1 材料与仪器

1.1 动物

健康普通级日本大耳白兔(由湖北武汉万千佳兴生物科技有限公司实验中心提供),实验动物许可证号为SCXK(鄂)2018-0022,雌雄不拘,体重在2.0 kg左右。本动物实验程序按照湖北理工学院实验动物伦理原则进行(动物伦理备案号:20210226)。

1.2 药物

山楂、甘草、桑叶3种中药材均来自劲牌研究院中药资源与中药组方研究室。经王道清工程师鉴定,采用的蔷薇科落叶灌木山楂的果实、豆科植物甘草的干燥根和根茎、桑科植物桑的干燥叶等均为纯正药材,符合《中国药典》(2015年版)要求。 以上3种药材的提取物经劲牌研究院天然药化研究室醇提工艺得到,提取条件均为:70%乙醇,温度70 ℃,浸提时间2 h,料液比1∶10。将得到的固体提取物配制成0.1、1、10 mg/mL 3种浓度。山楂、甘草、桑叶的中药提取物均以15%(v∶v)基酒完全溶解。

1.3 试剂

台式液由7种成分配制而成,分别称量氯化钠8.0 g、氯化钾0.2 g、无水氯化钙0.2 g、碳酸氢钠1.0 g、磷酸二氢钠0.05 g、氯化镁0.1 g、葡萄糖1.0 g(试剂生产厂家均为天津科密欧化学试剂有限公司),加水溶解并定容为1 000 mL,静置待用。

基酒(即山楂、桑叶、甘草提取物的溶媒):取15 mL的无水乙醇,加入纯水调节容积至100 mL,配成15%(v∶v)的基酒待用。

1.4 仪器

恒温平滑肌实验系统(中国成都泰盟仪器公司,型号HW200S);张力信号传感器(中国成都泰盟仪器公司,型号FT-100)。

2 实验方法

2.1 家兔小肠标本制备与平滑肌收缩信号记录

共计使用健康家兔8只,每次实验使用1只,实验前禁食10 h。用木槌击打头部处死家兔后,常规解剖家兔,在胃幽门下端取十二指肠4～6 cm, 放入盛有台式液的培养皿中,除去肠中内容物,洗净,将小肠两端用外科缝合线打结,制成离体标本;然后放入恒温平滑肌实验系统标本浴槽,与标本挂钩相连,肠段一端与肌张力传感器相连。肌张力传感器与BL-420S生物机能实验系统相连,打开BL-420S生物机能实验系统软件,在电脑屏幕上观察小肠正常收缩的曲线,以及加入中药提取物后收缩张力改变的曲线,记录小肠平滑肌最大收缩张力数值和收缩频率。

2.2 统计方法

BL-420S生物机能实验系统自动记录家兔十二指肠平滑肌收缩频率和收缩最大张力,用“均值±标准差”表示,使用SPSS16.0统计软件,使用单因素方差分析方法(one-way ANOVO)和t检验方法比较组间均值之间的差异,P<0.05为组间均值有显著性差异。

3 实验结果

山楂、桑叶、甘草的中药提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩频率的影响见表1。观察正常组、溶媒对照组以及3种中药提取物组间家兔的十二指肠平滑肌收缩频率,发现溶媒对照组与正常组相比无显著性差异,加中药提取物后小肠平滑肌收缩频率与正常组相比有显著性差异。

表1 山楂、桑叶、甘草的中药提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩频率的影响

3.1 家兔十二指肠平滑肌正常收缩张力曲线

经反复验证(重复次数超过8次)以及统计,家兔十二指肠平滑肌正常收缩张力平均为5.0 ±0.2 g,家兔十二指肠平滑肌正常收缩张力曲线如图1所示。

3.2 溶媒(15%基酒)对十二指肠平滑肌收缩的影响

待十二指肠平滑肌收缩信号稳定以后,加入溶媒(15%基酒)1 mL,观察平滑肌收缩张力信号的改变,溶媒(15%基酒)对家兔十二指肠平滑肌收缩力的影响如图2所示。经反复验证(重复次数超过8次),家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为5.20±0.36 g,经t检验统计分析,加入15%基酒后,十二指肠收缩张力值与正常收缩张力值相比无显著性差异(P>0.05),说明山楂、甘草、桑叶的中药提取物提取过程中使用的溶媒(15%基酒)对十二指肠平滑肌收缩张力无明显影响。

3.3 山楂提取物对家兔十二指肠收缩力的影响

观察并记录小肠平滑肌在正常情况下的收缩张力值,再往浴槽中按照浓度梯度依次加入0.1、1、10 mg/mL山楂提取物,每次1 mL,每次加入后观察并记录小肠收缩张力值。加入不同浓度的山楂提取物的家兔十二指肠收缩力的变化曲线如图3所示。不同浓度的山楂提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩力的影响如图4所示。经反复检验(重复次数超过8次)以及统计,加入0.1 mg/mL的山楂提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为6.00±0.22 g,与正常组相比P>0.05,无显著性差异。加入1 mg/mL的山楂提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为7.50±0.17 g,与正常组相比P<0.05,有显著性差异。加入10 mg/mL的山楂提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为8.60±0.32 g,与正常组相比P<0.01,有极显著性差异。

图4 不同浓度的山楂提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩力的影响(与正常组相比,*P<0.05,**P<0.01)

加入山楂提取物后小肠平滑肌的收缩张力与小肠正常张力值相比有显著性差异(P<0.05),收缩张力明显增大,显示山楂提取物对小肠有加强收缩作用,并且呈浓度依赖性,加入的提取物的浓度越大,小肠平滑肌的收缩力越强。

3.4 甘草提取物对家兔十二指肠收缩力的影响

观察并记录小肠平滑肌在正常情况下的收缩张力值,再往浴槽中按照浓度梯度依次加入0.1、1、10 mg/mL的甘草提取物,每次1 mL,每次加入后观察并记录小肠收缩张力值。加入不同浓度的甘草提取物的家兔十二指肠收缩力的变化曲线如图5所示,不同浓度的甘草提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩力的影响如图6所示。

(a) 0.1 mg/mL

图6 不同浓度的甘草提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩力的影响(与正常组相比,**P<0.01)

经反复检验(重复次数超过8次)以及统计,加入0.1 mg/mL的甘草提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为5.10±0.24 g,与正常组相比P>0.05,无显著性差异。加入1 mg/mL的甘草提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为4.2±0.2 g,与正常组相比P>0.05,无显著性差异。加入10 mg/mL的甘草提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为1.8±0.16 g,与正常组相比P<0.01,有极显著性差异。

经单因素方差统计分析,加入甘草提取物后,小肠平滑肌的收缩张力与小肠正常张力值相比有显著性差异(P<0.05),小肠收缩张力明显减小,显示甘草提取物对小肠有舒张作用,并且呈浓度依赖性,其提取物的浓度越大,舒张作用越强。

3.5 桑叶提取物对家兔十二指肠收缩力的影响

观察并记录小肠平滑肌在正常情况下的收缩张力值,再往浴槽中按照浓度梯度依次加入0.1、1、10 mg/mL的桑叶提取物,每次1 mL,每次加入后观察并记录小肠收缩张力值。加入不同浓度的桑叶提取物的家兔十二指肠收缩力的变化曲线如图7所示,不同浓度的桑叶提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩力的影响如图8所示。经反复验证(重复次数超过8次)以及单因素方差统计分析,加入0.1 mg/mL的桑叶提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为3.2±0.27 g,与正常组相比P>0.05,无显著性差异。加入1 mg/mL的桑叶提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为2.5±0.16 g,与正常组相比,P<0.01,有显著性差异。加入10 mg/mL的桑叶提取物后,家兔十二指肠平滑肌收缩张力平均为1.4±0.34 g,与正常组相比P<0.001,有极显著性差异。加入桑叶提取物后,小肠平滑肌的收缩张力与小肠正常张力值相比有显著性差异(P<0.05),张力明显减小,显示桑叶提取物对小肠有舒张作用,并且呈浓度依赖性,提取物的浓度越大,舒张作用越强。

(a) 0.1 mg/mL

图8 不同浓度的桑叶提取物对家兔十二指肠平滑肌收缩力的影响(“1 mg/mL”vs“15%的基酒”,**P<0.01;“10 mg/mL”vs“15%的基酒”,***P<0.001)

4 结论

经实验验证,浓度为1 mg/mL和10 mg/mL的山楂提取物乙醇溶液对小肠平滑肌有明显加强收缩的作用,浓度为10 mg/mL的甘草提取物乙醇溶液、浓度为1 mg/mL和10 mg/mL的桑叶提取物乙醇溶液对家兔小肠平滑肌具有明显加强舒张的作用,且桑叶提取物的舒张作用强于甘草提取物。3种中药提取物对小肠的收缩或者舒张作用强度呈现浓度依赖性。

5 讨论

山楂、桑叶、甘草3种中药提取物常加入我国白酒中作为功效成分。部分中药提取物或引起肠道收缩增强,或引起肠道舒张增强,如何科学地搭配中药提取物,使肠道收缩功能处于正常稳态是非常有意义的研究内容。我们发现山楂提取物使收缩频率显著性降低,而桑叶和甘草则使小肠收缩频率显著性增加,与收缩力正好是相反的实验结果。原因可能是收缩力和收缩频率是相互协调的,假如收缩频率和收缩力同时增加,则必然耗费平滑肌更多能量,维持不了更长时间,小肠的正常收缩必然受到影响,所以对收缩频率的影响还牵涉到小肠收缩的自我调节机制。

小肠平滑肌自动节律收缩活动就是由位于“纵行肌”和“环形肌”之间的Cajal间质细胞(Interstitial Cells of Cajal,ICC)产生的慢波节律而起步的。而这种自发活动的产生和传导易受到神经递质、离子、胃肠激素等生物活性物质和药物的影响[4]。ICC产生一种起搏电流触发的慢波电流,属于L2型Ca2+电流[5],因此平滑肌的舒缩依赖于细胞内Ca2+浓度的变化。肌细胞内Ca2+浓度增加主要通过胞内钙库的释放和胞外摄入两个途径。平滑肌收缩活动可因胞内Ca2+浓度的降低而减弱,反之增强。另外,小肠平滑肌受副交感神经纤维支配占优势,当副交感神经纤维兴奋时,神经末梢释放神经递质乙酰胆碱(Ach),小肠平滑肌细胞膜上分布有M型胆碱受体,乙酰胆碱(Ach)会和M型胆碱受体结合并激动M受体。如果山楂提取物中含有激动M型受体的成分或者能抑制胆碱酯酶的成分,类似于毛果芸香碱或新斯的明,则会引起平滑肌收缩增强,若桑叶提取物或者甘草提取物含有M受体阻断剂的成分,类似于阿托品,则会引起平滑肌松弛。

山楂、桑叶、甘草的提取物中含有多糖、黄酮、多酚等数十种成分,到底是哪一种单体成分发挥作用尚不清楚,以山楂为例,山楂确有消食之功效,消化不良者服用非常合适,但是空腹者或者有胃炎、胃溃疡者服用却并不适合,因为其可以刺激服用者胃酸大量分泌,胃酸的分泌与胃粘膜壁细胞上M胆碱受体有密切关系,典型的M胆碱受体阻断剂哌仑西平可以抑制胃酸分泌,所以山楂中可能含有激动M胆碱受体的成分。因此,以上3种中药提取物引起小肠平滑肌收缩增强或者舒张增强的详细机制涉及小肠平滑肌细胞膜上的M型胆碱受体、副交感神经-小肠平滑肌接头间隙内AchE的抑制以及平滑肌细胞内的Ca2+浓度变化等,十分复杂,详细机制尚有待进一步深入研究。