基于Sr稳定同位素和矿物元素的鲍鱼产地溯源技术研究

洪赫阳 张信泽 张秀珍 韩典峰 崔艳梅 赵军强 宫向红 徐英江

（1山东省海洋资源与环境研究院，山东省海洋生态修复重点实验室/烟台市海珍品质量安全控制与精深加工重点实验室，山东 烟台 264006；2上海海洋大学食品学院，上海 201306）

近年来，为保护不同产地资源特色，我国实施了对产品地理品牌的建设。以鲍鱼为例，自2006年以来，辽宁大连，山东长岛、荣成及福建连江鲍鱼相继被列为地理标志产品［1-4］。鲍鱼具有极高的营养和药用价值［5］，其主产区分布在辽宁、山东、福建和广州等地［6］，而不同的地域特征使得鲍鱼具有不同的品质和营养价值，如南方鲍的平均硬度和咀嚼度较高、北方鲍的弹性高［7］。随着人们对鲍鱼需求量增多，以次充好等情况时有发生［8］，严重损害了消费者的权益，因此，分析鲍鱼地域差异及研发可靠有效的产地溯源技术具有重要意义。

稳定同位素技术是国际上食品产地溯源与保护的前沿技术［9］。产地溯源研究中常用的稳定同位素包括碳（C）、氮（N）、氢（H）、氧（O）、硫（S）、铅（Pb）、锶（Sr）和钕（Nd）等［10］，近年来，Sr 稳定同位素因不受环境生物代谢、周围环境及饮食过程影响的特点而在农产品溯源研究中得到广泛应用［11］。相较于轻稳定同位素，Sr稳定同位素在气候条件差异较小的邻近区域产品判别时能发挥关键作用［12］。由于矿物元素组成和含量在水、土壤、饲料和空气环境中分布不均，导致不同地域矿物元素指纹特征存在差异［13］，因此，矿物元素可作为农产品产地溯源指标。但陆源生物中元素易受生长环境、栽培管理措施等因素的影响，水产品中元素易受养殖饲料添加、水体环境污染等因素影响［14］，使元素指纹图谱技术的应用存在一定局限性，因此，元素结合Sr 稳定同位素进行产地溯源的研究逐渐增多。如Li等［15］利用87Sr/86Sr 结合28 种矿物元素区分贵州蓝莓产地；康露等［16］利用87Sr/86Sr 和8 种矿质元素区分新疆甜瓜产地；还有探究葡萄酒地理起源的研究［17］。上述研究均取得了理想的判别效果，但鲜见探究鲍鱼产地追溯可行性的报道。

借助适当的化学计量学方法准确地筛选有效指标并提高鉴别的正确率是鲍鱼溯源研究的关键［11］，如Zhou 等［18］在婴儿奶粉溯源研究中指出，应用人工神经网络（artificial neural network，ANN）化学计量方法建立的模型判别效果较线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）模型更好。本试验以连江、长岛、荣成和大连4 个产地皱纹盘鲍（Haliotisdiscushannai）为研究对象，利用电感耦合等离子体质谱仪（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）分析不同组织中的87Sr/86Sr、88Sr/86Sr 和20 种元素含量特征及差异，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）、LDA 3 种化学计量学方法建立鲍鱼产地溯源模型，旨在为鲍鱼溯源体系建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硝酸（优级纯），德国默克公司；锶同位素标准物质（NIST SRM 987），美国国家标准局；扇贝标准物质（GBW10024），地球物理地球化学勘察研究所；多元素内标混合物（浓度100 μg·mL-1），美国安捷伦科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ICAP RQ 电感耦合等离子体质谱仪，美国Thermo Scientific 公司；ASX560 自动进样器，美国Teledyne CETAC公司；Topex-GT400全自动微波消解仪，上海屹尧仪器科技发展有限公司；Crymill冷冻研磨机，德国莱驰公司；Alpha 1-4LDplus冷冻干燥机，德国Chirst公司。

1.3 样品采集和制备

鲍鱼样品采集自福建省连江市、山东省（长岛县、荣成市）和辽宁省大连市3个省份的4个主要产区，不同产区地理气候环境具有一定差异，且连江具有典型的亚热带气候特征［19］。所有鲍鱼样品均于2021年9、10月采集，每个产区各选取大小相似的50 只鲍鱼，每只鲍鱼样品湿重约57.4～63.9 g。鲍鱼用超纯水清洗，对整只鲍鱼取壳肌、裙边、消化腺性腺及外套膜4 个组织，置于-80 ℃冰箱预冷冻24 h，再放入干燥机干燥48 h，取出研磨过筛（100目）后放入干燥器中保存待测。

称取样品（0.2±0.005）g 置于聚四氟乙烯消解罐中，加入10 mL 硝酸，加盖过夜，再放入微波消解仪中，具体条件见表1。冷却后将消解罐放在180 ℃控温电热板上，赶酸至体积小于1 mL，后定容至25 mL，混匀备用，同时做空白试验。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 Sr 稳定同位素的测定 使用ICP-MS 对样品中87Sr/86Sr、88Sr/86Sr 进行测定。配制80 μg·L-1Sr 标准溶液，试验采用插入监控物质，即每批样品测试时加入空白样品、重复样品和标准物质［20］。Sr 稳定同位素标准值为87Sr/86Sr=0.710 34±0.000 26、88Sr/86Sr=8.376 1±0.003 25，仪器精密度为0.35%和0.37%，表明测量结果具有良好的再现性。

1.4.2 元素含量的测定 对于元素同位素的选择，既要选择灵敏度和丰度高的同位素，又要避开同量异位素的干扰［21］，如64Ni+和64Zn+［22］。本试验测定了20 种元素，其同位素分别为11B、27Al、48Ti、51V、55Mn、59Co、63Cu、66Zn、71Ga、75As、77Se、88Sr、111Cd、137Ba、208Pb、7Li、23Na、24Mg、39K、44Ca。使用多元素混合标准溶液绘制标准曲线，采用1 μg·mL-1内标混合溶液（Se、Ge、Rh、In）校正仪器的漂移。仪器精密度（1.2%～6.4%）良好，该方法可用于鲍鱼元素的测定。

1.5 仪器工作条件

ICP-MS仪器开机预热至稳定后，用调谐液优化仪器参数，获得最佳工作条件。ICP-MS工作参数如下：发生器功率1 550 W；冷却气流量14.0 L·min-1；雾化气流量1.0 mL·min-1；氦气流量4.125 mL·min-1；雾化室温度2 ℃；采样深度5 mm；驻留时间0.02 s；重复次数3次；氧化物（140Ce16O/140Ce）≤2%；双电荷（137Ba++）/（137Ba+）≤3%。在He模式下进行样品测定，并在线引入1 μg·mL-1的内标溶液。

1.6 数据处理

采用SPSS 26.0 软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）及事后最小显著差异法（least significant difference，LSD）多重比较、PCA和LDA，采用Origin 2022b软件绘制雷达图和得分散点图，采用SIMCA 软件进行OPLS-DA及图形绘制，用Excel 2021进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 鲍鱼Sr稳定同位素比值及矿物元素的特征差异分析

表2 显示了鲍鱼不同指标指纹分布特征差异。经过LSD多重比较分析可知，4个组织中不同产地的87Sr/86Sr、88Sr/86Sr比值整体存在显著性差异（P＜0.05）。从组织来看，鲍鱼壳肌中87Sr/86Sr比值分布较裙边、消化腺性腺和外套膜偏正，而88Sr/86Sr比值分布较其他组织偏负，表明壳肌中87Sr/86Sr、88Sr/86Sr指标展现了明显的地域差异，与其他组织存在较大的分馏效应。从产地来看，除壳肌指标外，大连和荣成产区样本87Sr/86Sr、88Sr/86Sr值普遍高于连江和长岛，多数组织样本呈大连＞荣成＞长岛＞连江的趋势，这与纬度变化一致。

表2 鲍鱼中Sr稳定同位素比值和20种元素含量分布情况Table 2 Distribution of Sr stable isotope ratio and 20 elementsin abalone/（mg·kg-1）

4 个组织中不同产地20 种矿物元素（除消化腺性腺中Li元素）含量整体存在显著性差异（P＜0.05）。连江鲍鱼样品Sr、Pb、Cd元素含量相对偏高，长岛鲍鱼的4个组织中Cd元素含量均相对偏高，荣成鲍鱼As元素含量和大连鲍鱼B 元素含量均较其他产区偏高，且主要富集在壳肌中。整体来说，多数元素含量的产地特征存在相似性，即连江产地鲍鱼样品的元素含量相对偏高，而大连样品相对偏低，且组织间特征也存在相似性，即消化腺性腺的元素含量普遍高于壳肌、裙边和外套膜。根据表2 差异显著性分析可知，壳肌B、Al、Se、Ba、Li、K、Ca元素，裙边Mg元素，消化腺性腺Ti、Zn、K、Ca 元素在不同地域间展示了良好的地域差异性（P＜0.05）。

2.2 基于Sr稳定同位素和矿物元素的主成分分析（PCA）

对4个产地鲍鱼样品进行PCA 模型建立。结果显示，不同组织的检验统计量（kaiser-meyer-olkin，KMO）值均大于0.6，Bartlett 的球形度检验显著性均小于0.05，表明PCA分析可行。如表3所示，不同组织前3个主成分的累计方差贡献率在66%以上，可充分反映原始数据信息。利用其载荷矩阵绝对值做雷达图（图1），进一步筛选特征指标，即载荷绝对值越大，距离中心点越远，贡献率越大。结果表明，壳肌Ca、Sr、Mg、Mn、V、Li、Ti、Co、Se、Ba、K、87Sr/86Sr，裙边Ti、Al、Mn、Ca、Ga、Sr、Li、Ba、V、K、Cd，消化腺性腺Ti、Ca、B、Na、Ga、Pb、Mg、Mn、Sr、Al、Cd，外套膜Sr、Mn、As、V、Ca、Se、Co、K、Ti、Mg、Zn、Pb、Cd 的载荷绝对值在0.7～1.0 之间，可基本反映主成分的信息。再绘制得分散点图（图2），可见不同组织PCA 模型可在一定程度上将4 个产地的鲍鱼区分开来，但不同产地样品间依然存在重叠现象，因此采用判别分析进一步对4 个产地鲍鱼样品进行鉴别。

图1 不同组织鲍鱼前3个主成分载荷绝对值雷达图Fig.1 Radar chart of absolute values of the first three principal component loads in different tissues of abalone

图2 不同组织鲍鱼的主成分因子得分图Fig.2 Principal component factor scores of abalone in different tissues

表3 不同组织鲍鱼Sr稳定同位素和矿物元素的PCA结果Table 3 Principal component analysis results of Sr stable isotopes and multi-element from different tissues in abalone

2.3 基于Sr稳定同位素和矿物元素的判别分析

2.3.1 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA） 本研究以22 个指标作为因变量，不同产地作为自变量，构建溯源模型。不同组织自变量（R2x）、因变量（R2y）拟合指数和模型预测指数（Q2）均大于0.5，表示模型拟合结果可接受［23］。

如OPLS-DA 得分图（图3）所示，不同组织具体判别结果如下：壳肌和裙边均可将连江、荣成和大连鲍鱼明显区分开来，消化腺性腺可显著区分连江和大连样品，外套膜中心点处得分存在重叠现象，判别效果略差。根据变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）大于1 确定的模型显著变量，壳肌、裙边、消化腺性腺、外套膜中显著变量指标分别为88Sr/86Sr、87Sr/86Sr、Cd、K、V、Zn、Cu、Se；B、Cd、As、Al、Ba、Ga、Se；88Sr/86Sr、Cd、B、Na、Ca、Se、Ba、Co、As；88Sr/86Sr、B、Li、Ga、Al、Cu、Cd、Zn。

图3 不同组织鲍鱼OPLS-DA得分图（左）和VIP贡献图（右）Fig.3 Discriminatory score graph （left） and VIP contribution graph （right） of OPLS-DA of different tissues in abalone

对4个产地鲍鱼模型进行判别分析，结果如表4所示。壳肌、裙边、消化腺性腺、外套膜总体正确判别率分别为99%、97%、99%和95%，其中连江和荣成消化腺性腺指标均可100%正确识别样品产地，长岛和大连正确判别率均为98%，溯源效果最优。因此，OPLSDA 可将4 个产地鲍鱼样品准确地区分开来，展现了OPLS-DA较好的判别能力。

表4 不同组织鲍鱼OPLS-DA判别结果Table 4 Discriminant results of OPLS-DA of different tissues in abalone

2.3.2 线性判别分析（LDA） 利用Fisher 判别函数对鲍鱼不同产地样品进行线性判别分析，并结合留一交叉验证法（Leave-One-Out Cross Validation）对判别结果进行准确性评估。结果显示，单独以87Sr/86Sr和88Sr/86Sr 为分析指标，鲍鱼4 种组织正确判别率较低，均小于90.0%。故针对此问题，进一步探究Sr 稳定同位素与矿物元素指标结合的溯源能力。

为了提高实际检测效率，采用逐步判别分析法进行分析。通过威尔克Lambda 分析可知，4 种组织均得出了3 个典型判别函数（α=0.01），其中，前2 个判别函数的累积贡献率在76.8%以上，以此做得分散点图，如图4-A～D 所示，壳肌和裙边可将连江、长岛和荣成鲍鱼样品有效区分开来；消化腺性腺可将大连鲍鱼与长岛荣成两地鲍鱼区分开，但荣成部分样品与长岛分数重叠；外套膜中不同产地样品均出现重叠现象。

对4 个产地的鲍鱼样品进行归类（表5），结果如下：壳肌B、Al、Ti、As、Se、Sr、Cd、Ba、Li、Na、Mg、K、87Sr/86Sr，裙边B、Ti、Co、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba、Na、Mg、Ca、88Sr/86Sr，消化腺性腺V、Mn、Cu、Zn、Ga、As、Se、Sr、Cd、Pb、Mg、K、Ca、87Sr/86Sr，外套膜B、Ti、V、Cu、Ga、Se、Sr、Li、Na、Mg、Ca、87Sr/86Sr进入了判别模型，其交叉验证正确判别率分别为97.0%、97.5%、99.0%和96.0%，正确率均在96%以上，效果良好。与单独使用Sr 稳定同位素相比，结合判别使4 种组织正确率均明显提高，尤其是壳肌指标的正确率由56%提升至97%，说明结合判别溯源效果优于单一判别。此外，如图4-A～C 和表5 所示，肌肉组织（壳肌、裙边）可区分长岛和荣成样本，消化腺性腺可区分大连与长岛样本，二者结合建模可成功将所有产地样品区分开（图4-E、F），100%精准识别4个产地的样本。

表5 不同组织鲍鱼LDA结果aTable 5 Fisher linear discriminant analysis results of different tissues in abalone

3 讨论

3.1 不同产地对Sr 稳定同位素比值及矿物元素的指纹分布影响

Sr有4种天然存在的同位素，即84Sr、86Sr、87Sr和88Sr，一般认为87Sr 是可变的，84Sr、86Sr 和88Sr 之间的比值为常数［24］。河流的87Sr/86Sr 取决于平均基岩年龄和成分流域［25］，在食品溯源中的优势在于，在加工之后直至最终产物，Sr 始终保持其原始同位素比率不变。本研究中，我国不同地区的87Sr/86Sr 范围较Gregorčič 等［26］对斯洛文尼亚地域牛奶溯源研究的比值范围偏正，表明87Sr/86Sr 在不同国家有较大的地质差异。前人研究表明，地质体在化学风化和碳酸盐结核等过程中，其88Sr/86Sr 也可能发生显著变化［27-28］。本研究同样发现，88Sr/86Sr 在不同产地分布范围有较显著差异，说明88Sr/86Sr是可变的，两种Sr比值特征分布均表现为大连样品比值相对偏高，连江样品比值相对偏低，究其原因，一是风化期间的分馏效应会导致同位素Sr 的损失［27］，一般情况下，在湿热地区化学风化作用占主导地位［29］，使连江样品比值偏低；二是Sr 稳定同位素与地质特征和地理气候环境相关。本试验中4 个产地纬度值与Sr 稳定同位素特征分布一致。此外，本研究发现，壳肌中87Sr/86Sr 存在较大的地域差异，由于肌肉的细胞更新速度较慢，稳定同位素特征达到稳定状态的平衡时间较长，更容易反映时间尺度上的变化情况［30-31］，因此，壳肌指标更能反映长期鲍鱼产地差异。

生物体不能自行合成矿物质元素［32］，因此其元素特征的差异反映了周围环境（即水和沉积物）和饮食的化学成分［33］。由于海水中重金属会在食物网中累积，导致不同地区生物体中重金属含量产生较大差异，重金属含量偏高的现象与人类活动息息相关［34］。福建连江养殖密度过大、生活垃圾、工业排污等水体污染都会造成水体富营养化［35］。本研究连江鲍鱼中尤其以Sr、Pb 和Cd元素含量较高，且富集在不同组织中，这是因为元素的代谢在不同组织和器官中存在差异，摄入的元素首先经过消化道，再到达二次积累器官［36］。工业废水是海水主要污染途径，其排放会使近海海水和浮游生物体内的Cd含量不断增高［37］。由此推测，本研究长岛鲍鱼4个组织中Cd元素含量均相对偏高与工业废水的排放相关。有研究表明，野生捕捞鱼类较养殖的As、Se、K浓度较高［38］，这与本研究中荣成鲍鱼指纹特征一致，推测三种指标可在一定程度上反映鲍鱼原产地信息。

3.2 影响鲍鱼不同产地判别率的因素

不同海域根据地理条件不同，使Sr 稳定同位素均具有产地指纹特征。连江和荣成分别位于台湾海峡和黄海海域，其地理气候特征具有显著差异［19］，纬度也相差较大，这使得连江和荣成多数指标产地判别良好。渤海海域因三面环陆的特殊地理构造，使得海水交换能力受到限制，海洋生态系统易受到沿岸人类活动的干扰［39］。大连和长岛同处于渤海海域，地域较近，导致本研究单独使用一种组织建模难以将4个产地鲍鱼区分开，小空间尺度难以对样品100%判别［16］。OPLSDA 和LDA 结果表明，消化腺性腺单独判别时，均体现了较好的产地区分效果，但消化腺性腺只能反映鲍鱼短期内溯源指标信息［29］，因此可将肌肉组织和消化腺性腺结合溯源，肌肉组织代表了长期元素富集情况，而具有高代谢活性的消化腺性腺主要倾向于反映近期的元素富集情况［40］，二者结合能100%区分4个产地鲍鱼样品。两种组织的联合鉴别为距离较小的产地溯源研究提供了方法参考。

虽然单独使用Sr 稳定同位素对鲍鱼溯源的表现并不乐观，但将其作为辅助指标仍有加成的效果，如Won等［41］认为多重稳定同位素分析可有效应用于菲律宾蛤仔的产地追溯。李启航［20］在蓝莓产地溯源研究中指出，Sr稳定同位素结合元素建模后判别率由81.3%提升至93.8%。本试验将Sr稳定同位素与20种元素结合对鲍鱼产地溯源，其判别效果最优，高于单独使用Sr稳定同位素溯源，表明Sr 稳定同位素和元素结合判别是鲍鱼产地溯源的有效方法。

4 结论

本研究采用Sr 稳定同位素与矿物元素联合的分析方法对鲍鱼的产地进行追溯。结果表明，不同产地指标（除消化腺性腺中Li 元素）整体差异显著，具有较明显的地理特征。采用PCA、OPLS-DA和LDA对不同产地鲍鱼建模，结果表明，壳肌、裙边、消化腺性腺和外套膜可基本实现鲍鱼4 个产地的判别，其中无监督的PCA方法无法完全区分4个产地鲍鱼样品，但证明了指纹图谱技术溯源的可行性；OPLS-DA模型溯源的正确判别率分别为99.0%、97.0%、99.0%和95.5%，LDA模型溯源交叉验证正确率分别为97%、97.5%、99.0%和96.0%，两种化学计量学方法均可有效鉴别鲍鱼产地，但OPLS-DA模型在肌肉组织的判别中效果较好。此外，肌肉组织（壳肌或裙边）和消化腺性腺的溯源效果互补，二者指标结合溯源可对4个产地鲍鱼100%精准判别。