斩拌处理对鱼糜肌原纤维蛋白结构特性的影响及效应分析

朱士臣 任晓露 魏传双 丁玉庭 周绪霞

（1浙江工业大学食品科学与工程学院/浙江省深蓝渔业资源高效开发利用重点实验室/国家远洋水产品加工技术研发分中心（杭州），浙江 杭州 310014；2海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034）

鱼糜制品是指以冷冻鱼糜为原料，经解冻、加盐斩拌混入淀粉等辅料制成的一种具有弹性的凝胶结构食品［1］，因其独特的质构特性和丰富的营养价值而深受消费者青睐［2］。斩拌是鱼糜工业化生产的关键步骤之一，是促进鱼糜肌原纤维蛋白溶出的有效方法。斩拌过程中所产生的剪切作用可破坏鱼糜的肌纤维超微结构，导致肌纤维解离，同时在NaCl 作用下促使盐溶性蛋白溶出并形成肌动球蛋白溶胶［3-4］，进而在加热条件下形成肌动球蛋白凝胶［5］。斩拌过程中的关键工艺参数会直接影响鱼糜制品的加工品质，如斩拌时间、NaCl添加量等。马瑶兰等［6］研究发现常压斩拌条件下，添加2%的NaCl可使阿拉斯加狭鳕鱼糜凝胶强度达到最大。同时许帅强等［7］发现斩拌阶段NaCl 的添加会促进肌原纤维蛋白的无规则卷曲向有序蛋白二级结构（β-折叠）转变，进而影响凝胶品质。焦道龙等［8］研究了斩拌初始温度对鱼糜的凝胶特性、保水性等理化特性的影响，发现斩拌初始温度较低或较高都不利于鱼糜凝胶的形成，温度过低易导致鱼糜再次冻结，造成斩拌不均匀而影响制品品质，而温度过高会导致鱼肉蛋白变性，亦会影响鱼糜加工特性。因此，阐释鱼糜肌原纤维蛋白在斩拌过程中的结构变化对于优化斩拌条件具有一定意义。

斩拌的目的是通过剪切作用使物料混合，促进鱼糜肌原纤维蛋白溶出，而不变性。斩拌作用使得鱼糜蛋白具有功能性，即肌肉蛋白质获得胶凝特性。在该过程中蛋白质的变化分为两个阶段：首先，在混合过程中蛋白质结构伸展；然后，在加热过程中蛋白质三维凝胶网络重组。Ducept等［9］研究发现在斩拌混合第一阶段，物料体积减小、混合，促进了蛋白质的增溶，而增溶效果与蛋白的胶凝化潜力密切相关。鱼糜斩拌过程中的力学效应可促进鱼糜肌原纤维蛋白充分溶出，但斩拌过程中所产生的热效应会不可避免地影响肌原纤维蛋白的结构特性，进而降低鱼糜加工品质。例如，鱼糜斩拌过程中斩拌速度过快或斩拌时间较长所产生的热效应会使得鱼糜体系局部温度升高，导致鱼肉肌原纤维蛋白变性，-SH基团氧化成二硫键，促进肌原纤维蛋白分子的聚集，从而降低鱼糜的加工特性［4］。由此可见，斩拌过程所产生的温度负面效应会导致机械促进效应的滞后。但如何保持斩拌过程中两效应的作用平衡以最大程度地改善鱼糜加工品质，尚鲜见相关报道。

鉴于此，本研究以应用较为广泛的鳕鱼鱼糜为模型，通过控制斩拌时间，研究不同NaCl 添加量的鱼糜在斩拌过程中的理化及结构特征变化（溶解度、粒径、总巯基含量、表面疏水性、Ca2+-ATP 酶活性、内源荧光强度变化等），并基于线性模型冗余分析探究斩拌处理条件（粒径变化）、热效应（温度变化）与蛋白质氧化变性指标间的相关性，旨在确定影响鱼糜肌原纤维蛋白氧化变性的关键因子，为调控鱼糜斩拌条件、提高鱼糜的加工品质提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳕鱼鱼糜购自浙江兴业集团有限公司；盐购自中盐上海市盐业有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JR5D-300 绞肉机，浙江苏泊尔股份有限公司；CR21GII 型高速冷冻离心机，日本日立公司；HH-1 型数显恒温水浴锅，江苏金坛市江南仪器厂；TA-XT2i型物性测试仪，英国Stable Micro System 公司；UV-VIS 紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；ZS2000 激光粒度仪，英国马尔文公司；T18 高速分散机，德国艾卡仪器设备有限公司；925 接触式测温仪，德国德图公司；F-2500 荧光分光光度计，日本日立公司；TA-XT2i型物性测试仪，英国SMS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼糜制备及温度测定 称取冷冻鱼糜，4 ℃半解冻10 h 后，切成1 cm×1 cm×1 cm 的小块，放入预冷的斩拌机中（四周均被碎冰包裹），使用低档位在600 r·min-1转速下斩拌30 s；加入不同浓度的NaCl（1%、2%、3%），再斩拌3 min，每20 s 停止10 s，以避免电机过热，分别在10、60、120、180 s时使用接触式测温仪各取6 个点分别测量体系温度，取样（约2 g）置于4 ℃冰箱储存。

1.3.2 肌原纤维蛋白提取方法 参考Gao 等［10］的方法并稍作修改。称取2 g 鱼糜，加入10 倍体积的Tris-HCl（20 mmol·L-1，pH 值7）缓冲液，7 400 r·min-1均质匀浆15 s，2 次，冷冻离心（10 000 r·min-1、10 min）。取沉淀加入10 倍体积含有0.6 mol·L-1NaCl 的Tris-HCl（20 mmol·L-1，pH 值7.0）缓冲溶液，均质15 s。4 800 r·min-1、4 ℃抽提1 h，离心（4 ℃、10 000 r·min-1）10 min，上清液即为肌原纤维蛋白。

1.3.3 溶解度的测定 参考Kittiphattanabawon 等［11］的方法，将蛋白质浓度调节至4.0 mg·mL-1，离心（4 ℃、10 000 r·min-1、15 min）。取上清液，用双缩脲法测定溶液中蛋白质含量，空白组使用磷酸盐缓冲溶液替代。计算公式如下：

1.3.4 总巯基含量的测定 参考林婉玲等［12］的方法，取0.5 mL 4 mg·mL-1蛋白溶液，加入4.5 mL 0.2 mol·L-1的Tris-HCl 缓冲溶液（含8 mol·L-1尿素，2%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），10 mmol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），pH 值6.8），40 ℃反应30 min，于412 nm处测定吸光值。巯基（SH）计算公式如下：

式中，A 为412 nm 处的吸光值；D 为稀释倍数，11；ε 为摩尔消光系数，13 600 L·mol-1·cm-1；C 为蛋白浓度，4 mg·mL-1。

1.3.5 表面疏水性的测定 参照Chelh 等［13］的方法并略作修改。取1 mL 蛋白浓度为4 mg·mL-1的样品溶液并向其中加入80 μL溴酚蓝（bromophenol blue，BPB，1 mg·mL-1），室温下涡旋10 min，然后在8 000 r·min-1下冷冻离心15 min。收集0.4 mL上清液并稀释10倍，于595 nm波长下测定吸光值A。溴酚蓝空白样：80 μL溴酚蓝溶解于Tris-HCl 缓冲溶液（20 mmol·L-1，pH 值7.5）。表面疏水性用溴酚蓝含量表示，其计算公式如下：

1.3.6 平均粒径的测定 将样品蛋白浓度调节至0.25 mg·mL-1，取1 mL稀释样品于马尔文比色皿中，在25 ℃下以90°的检测角进行动态光散射（dynamic light scattering，DLS）测量，其结果反映了微粒的平均粒径。

1.3.7 Ca2+-ATP 酶活性的测定 参考卢涵［14］的方法，将肌原纤维蛋白溶液浓缩至4 mg·mL-1左右。在试管中依次加入2.5 mL 20 mmol·L-1的Tris-HCl（pH 值7.0）、1 mL 0.05 mol·L-1的CaCl2、1 mL 4 mol·L-1的KCl溶液、1.5 mL 6.67 mmol·L-1的ATP-Na2，最后加入4 mL酶液，于28 ℃水浴锅中准确反应30 min，反应结束迅速加入1 mL 15%的三氯乙酸停止反应。对照组自酶液加入后就加入三氯乙酸停止反应。双层滤纸过滤反应溶液。准确吸取滤液2.00 mL，置于25 mL具塞试管中，加入2 mL 钼酸铵溶液（50 g·L-1），摇匀，静置。加入1 mL 亚硫酸钠溶液（200 g·L-1）、1 mL 对苯二酚溶液（5 g·L-1），摇匀。加水至刻度，混匀。静置0.5 h后测定660 nm波长的吸光值（A660）。酶活性计算公式如下：

式中，m 为生成的无机磷量（μmol）；t为反应时间；M 为肌原纤维蛋白含量（mg）。其中，无机磷含量由A660经无机磷含量标准曲线计算得到。

1.3.8 荧光强度的测定 将样品溶液离心（8 000 r·min-1，15 min），使用双缩脲法测定其蛋白质浓度，并使用缓冲溶液将样品溶液蛋白质浓度调节一致（4 mg·mL-1），放入石英荧光比色皿中，采用F-2500荧光分光光度计测定溶液中蛋白质分子的荧光强度，设置激发波长280 nm，发射波长300～400 nm，激发狭缝和发射狭缝均为5.0 nm，电压400 V。

1.3.9 凝胶强度的测定 将斩拌后的鱼浆灌入胶原蛋白肠衣内（Φ 22 mm），排空气泡后两端扎紧，采用两段式加热（40 ℃加热1 h，90 ℃加热20 min），随后立即冷却，4 ℃冷藏过夜。将鱼糜凝胶切成22 mm×20 mm的圆柱体在室温下平衡30 min，然后采用TA-XT2i 型物性测试仪测定凝胶强度。参数设定如下：探头P/5 S；测前速度1.00 mm·s-1；测试速度2.00 mm·s-1；测后速度10.00 mm·s-1；位移15 mm；触发力10 g。每组样品平均测定10次取平均值。

1.3.10 相关性分析 采用线性冗余模型进行相关性试验，确定鱼糜斩拌过程中的斩拌条件与蛋白氧化之间的关系。该模型包含斩拌过程中响应变量（如蛋白氧化变性指标）和一组解释变量（斩拌时间、斩拌温度）。本研究基于相关性定性描述斩拌条件与蛋白氧化变性之间的相关性，包括样本、响应变量和解释变量。两个变量之间的相关水平通过对应向量间的夹角大小进行表示：角度＜90°为正相关性，角度越小表明正相关性越强；角度=90°表示不存在相关性；角度＞90°为负相关性，角度越大则表示负相关性越强［15］。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0 软件进行数据显著性分析，并采用Origin 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 斩拌过程鱼糜的温度变化

斩拌温度是影响鱼糜制品加工品质的重要因素之一。由于斩拌过程中刀片与物料摩擦产生的机械作用不可避免导致热效应的产生［16］，使鱼糜体系温度升高，进而可能导致鱼肉肌原纤维蛋白变性［17］。由图1可知，所有鱼糜样品在斩拌的0～60 s 内温度基本保持不变，但随着斩拌时间进一步延长，热效应增加，导致1%、2%、3%三组鱼糜的温度分别从0 s 的-2、-1.1、-1.8 ℃显著升高至180 s 的7.1、6.5、5.7 ℃。斩拌过程中所产生的热量变化是否导致了鱼糜肌原纤维蛋白变性，需要进一步研究。

图1 添加不同NaCl的鱼糜斩拌过程中的温度变化Fig.1 Temperature changes of surimi with the different additions of NaCl during chopping treatments

2.2 总巯基含量

巯基是肌原纤维蛋白中最为活跃的反应性基团之一，其含量反映了蛋白质氧化变性程度［16］。总巯基含量包括暴露在蛋白表面和埋藏其内部的巯基含量。由图2 可知，斩拌60 s 时，添加2%、3%试验组的总巯基含量相对于第10 秒分别上升17.9%、21.2%。然而随着斩拌时间的持续延长（120～180 s），总巯基含量保持平稳或有所降低。而在相同斩拌时间下，较高食盐添加量组具有较高的总巯基含量，特别是在斩拌初期（10～60 s）更为显著。

图2 添加不同NaCl的鱼糜在斩拌过程中总巯基含量变化Fig.2 Changes of total sulfhydryl contents in surimi with the different additions of NaCl during chopping treatments

2.3 表面疏水性

溴酚蓝可以与蛋白质疏水性氨基酸残基结合，结合溴酚蓝的含量变化可反映疏水性氨基酸残基的暴露程度［18］。由图3可知，随着斩拌时间延长，溴酚蓝含量逐渐增加，即：疏水性氨基酸暴露程度逐渐增大。相较于斩拌10 s 样品组，斩拌120 s（添加1%、2%、3%NaCl）样品组的溴酚蓝含量分别上升了35.2%、31.0%、6.6%。随着斩拌时间的持续增加（120～180 s），溴酚蓝含量逐渐增加，添加1%、2%、3%NaCl 试验组的溴酚蓝含量相较于第120 s组分别增加了11.4%、4.0%、7.1%。

图3 添加不同NaCl的鱼糜在斩拌过程中表面疏水性的变化Fig.3 Changes of surface hydrophobicity of surimi with different NaCl during chopping treatments

2.4 Ca2+-ATP酶活性

肌球蛋白的球状头部区域具有Ca2+-ATP 酶活性，因此Ca2+-ATP 酶活性能够反映斩拌过程中肌原纤维蛋白分子的完整性［16］。由图4 可知，随着斩拌时间延长，1%、2%、3% NaCl添加量鱼糜样品的肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性逐渐降低。在斩拌时间达到180 s时，Ca2+-ATP 酶活性显著下降（P＜0.05）。此外，相同斩拌时间下，1%和2% NaCl添加量组样品的Ca2+-ATP酶活性无显著差异。

图4 添加不同NaCl的鱼糜在斩拌过程中Ca2+-ATP酶活性变化Fig.4 Changes of Ca2+-ATPase activity in surimi with different NaCl during chopping treatments

2.5 溶解度

肌原纤维蛋白质溶解度的变化通常与其结构变化有关。如图5 所示，在斩拌时间为60 s 时，1%、2%、3%NaCl 添加量的鱼糜在斩拌过程中肌原纤维蛋白溶解度达到最大值。相较于斩拌10 s 的样品组，斩拌60 s 1%～3% NaCl 添加量组的肌原纤维蛋白溶解度分别增加17.8、10.1、12.3 个百分点。随着斩拌时间进一步延长，鱼糜肌原纤维蛋白溶解度逐渐下降。同一斩拌时间下，NaCl 量的增加能够显著促进肌原纤维蛋白的溶出（P＜0.05）。

图5 添加不同NaCl的鱼糜在斩拌过程中溶解度变化Fig.5 Changes in solubility of surimi myofibrils with different NaCl during chopping treatments

2.6 平均粒径

Z-平均流体力学直径能够反映体系中微粒的粒径大小、分布以及聚集状态［19］。由图6可知，相较于斩拌时间10 s 样品组，斩拌时间120 s 的1%、2%、3%NaCl 试验组的粒径分别上升104.0%、129.1%、76.7%。然而当斩拌时间增加至180 s 时，粒径显著下降，分别较120 s 组下降了19.8%、32.9%、13.7%。相同斩拌时间下，较高NaCl 添加量的样品组具有较大的粒径。这是由于NaCl 添加量的增加促进了肌原纤维蛋白的溶出，进而促进了蛋白质分子交联聚合，从而使粒径增大［17］。

图6 添加不同NaCl的鱼糜在斩拌过程中粒径变化Fig.6 Changes in particle size of surimi with different NaCl during chopping treatments

2.7 内源荧光光谱

内源荧光主要反映蛋白质分子中色氨酸等疏水性氨基酸残基的荧光特性及所处环境的变化情况，可以用于表征蛋白质的构象变化［20］。由图7 可知，斩拌时间为60 s 时的肌原纤维蛋白荧光强度较10 s 有所增强，即色氨酸从蛋白内部转移至溶剂环境中，发生红移，说明在斩拌过程中，鱼糜蛋白质结构舒展，色氨酸等疏水基团暴露，荧光强度随之增强［19］。这与溶解度、疏水性的变化趋势一致。

图7 不同NaCl添加量的鱼糜在斩拌过程中的肌原纤维蛋白内源荧光光谱变化Fig.7 Changes of myofibrillar protein endogenous fluorescence spectra of surimi supplemented with different amounts of NaCl during chopping treatments

2.8 凝胶强度

由图8 可知，经不同时间斩拌的鱼糜的凝胶强度有明显差异。相较于斩拌10 s 时的凝胶强度，斩拌处理180 s 时，添加1%、2%、3% NaCl 试验组的鱼糜凝胶强度分别上升43.6%、33.6%、26.8%。鱼糜凝胶强度的提高可能与斩拌过程中引起的肌原纤维蛋白理化性质和结构变化有关。此外，相同斩拌时间处理的鱼糜，其凝胶强度随着NaCl添加量的增加而增强。

图8 添加不同NaCl的鱼糜在斩拌过程中凝胶强度变化Fig.8 Changes of gel strength of surimi with different NaCl during chopping treatments

2.9 斩拌条件与蛋白质氧化相关性分析

鱼糜斩拌过程产生的机械效应促使肌原纤维蛋白溶出的同时，过度的机械处理和由此衍生的热效应会破坏肌原纤维蛋白结构，导致蛋白质结构破坏和变性。基于线性模型冗余分析分别对斩拌处理条件（粒径变化）、热效应（温度变化）与蛋白质结构特性指标进行相关性分析，确定鱼糜斩拌过程中导致肌原纤维蛋白氧化变性的关键因子，结果如图9 所示。斩拌时间与粒径分布之间的正相关性最强，同时与表面疏水性、总巯基含量、溶解度等指标也呈正相关，但正相关程度依次减弱，与溶解度呈负相关。同时，温度与疏水性、总巯基含量之间的正相关性均弱于斩拌时间与蛋白质结构特性间的相关性。由此可知，斩拌过程主要通过机械作用影响蛋白粒径分布、表面疏水性以及总巯基含量，而非斩拌过程中产生的局部热效应所诱导的肌原纤维蛋白变性。

图9 斩拌过程中温度变化、微粒特性与蛋白质变性相关性分析Fig.9 Correlation analysis of temperature change，particle properties and protein oxidation denaturation during chopping treatments

3 讨论

本研究结果表明，相同斩拌时间添加不同量食盐的鱼糜体系温度略有不同，推测与NaCl 溶解吸收体系热量有关［21］。斩拌初期，总巯基含量有所上升，随着斩拌程度加深（120～180 s），总巯基含量保持平稳或有所降低，与马瑶兰等［6］的研究结果基本一致。在斩拌初期，机械力的剪切作用使得起初包裹在蛋白质内部的巯基逐渐暴露出来，且暴露速率大于巯基氧化速率［22］，二者共同作用使得总巯基含量呈上升趋势。然而随着斩拌程度的增强，斩拌过程产生的热效应及促氧化因子的介入使得总巯基含量有所下降。在斩拌初期（10～60 s），相同斩拌时间下，较高食盐添加量组具有较高的总巯基含量。这可能是由于随着NaCl 添加量的增加，肌原纤维蛋白更易溶出，使得更多巯基基团暴露。同时Ca2+-ATP 酶活性也与肌球蛋白头部的巯基密切相关［23］。随着斩拌时间延长，斩拌过程中的机械效应及热效应可能导致肌球蛋白球状头部的构象变化，导致该区域Ca2+-ATP酶活性降低［24］。

本研究发现，随着斩拌时间延长，表面疏水性逐渐增大。这可能是由于斩拌过程中的剪切作用破坏了鱼糜肌动球蛋白的空间结构，分子内部的疏水性氨基酸残基逐渐暴露于蛋白质表面，从而导致肌原纤维蛋白表面疏水性增加［25］。在疏水相互作用下，肌原纤维蛋白分子发生聚集，导致粒径增大。但随着斩拌时间进一步增加，斩拌过程所产生的机械作用会使蛋白质聚集体解聚，从而使粒径降低［23］。

本研究发现，斩拌过程中鱼糜肌原纤维蛋白溶解度呈现先上升后下降趋势。这可能是由于斩拌初期的机械作用破坏肌纤维组织，有利于肌原纤维蛋白溶解［26］。而斩拌后期（120～180 s），蛋白质发生变性，造成溶解度持续下降；同时，随着斩拌时间的延长，鱼糜凝胶强度显著提高。这可能与斩拌过程引起的肌原纤维蛋白理化性质和结构变化有关。在斩拌过程中，蛋白质结构伸展，肌原纤维蛋白内部的官能团暴露［27］，在氢键及疏水相互作用下形成了更紧密均一的三维凝胶网络，使得凝胶强度增大［28］。

综上分析，随着斩拌时间的延长，肌原纤维蛋白溶解度、总巯基含量和粒径总体呈先上升后下降趋势，Ca2+-ATP酶活性逐渐降低，表面疏水性增强，鱼糜凝胶强度在斩拌后期显著增加。线性模型冗余分析结果表明，鱼糜斩拌过程主要是通过机械作用导致肌原纤维蛋白的氧化变性，而非斩拌过程中产生的局部热效应。

4 结论

本试验探究了添加不同浓度NaCl 的鱼糜在斩拌过程中肌原纤维蛋白的结构变化规律，并基于线性模型冗余分析了斩拌过程中的机械效应（粒径变化）及热效应（温度变化）与蛋白质氧化变性指标的相关性，从而确定鱼糜斩拌过程中导致肌原纤维蛋白氧化变性的关键影响因子。结果表明，鱼糜斩拌过程中的机械力效应是导致肌原纤维蛋白氧化变性的主要因子，斩拌过程中产生的局部热效应对鱼糜肌原纤维蛋白的氧化作用影响有限。因此，在后续研究中，在斩拌过程除采取物理控温外，可通过优化鱼糜斩拌条件来减小斩拌机械力对鱼糜肌原纤维蛋白的负面影响，从而进一步提高鱼糜制品加工品质。