基于海藻酸的包衣剂对甜玉米种子活力、抗氧化酶系统和产量的影响

吉状状 谭 韵 黄众基 丁云倩 朱庆祥 金 鹏 王晓敏 赵光武

（浙江农林大学现代农学院，浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300）

甜玉米（ZeamaysL.）因种皮较薄、内溶物质均一、含糖量高等突出的食味品质而广受全球多个地区人们的喜爱。甜玉米的独特风味是由于胚乳基因发生了隐性突变，使淀粉积累少于普通玉米，同时导致种子活力较普通玉米更容易降低。较低的种子活力表现为发芽率低、苗期生长弱、抗逆能力差等［1］，对甜玉米的品质和产量造成更为严重的影响。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是种子活力降低的主要因素之一。ROS 在种子中的积累会氧化损伤脂质、DNA 和蛋白质，进而影响种子活力［2］。为应对ROS 积累对细胞的损伤，植物体会启动抗氧化酶清除系统以保持细胞内稳定微环境，该系统主要包括过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和过氧化氢酶（catalase，CAT）等［3］。目前，甜玉米种子活力低是制约甜玉米产业发展的关键问题。

研究表明，种子包衣技术是一种提高种子活力的常用技术手段［4］。种子包衣中的功能成分包括多种物质，如生长调节剂、杀虫剂、化肥和微生物。包衣剂可使有效成分精准作用于种子周围，提高功能物质利用率，降低田间农药的喷施和大量肥料的施用，减少环境污染。种子包衣技术的合理利用对农业生产、环境保护等具有重要意义。种子包衣处理有效减少了病虫害的发生，提高了作物产量和质量［5］。

随着现代种业技术的发展，包衣剂的种类和包衣方法呈多样化趋势，尤其是机械包衣技术的不断改进，使得种子包衣质量及工作效率得到进一步提高。但使用化学物质作为种子包衣添加剂时极易对土壤、水资源和生物造成不利影响［6］，因此，开发一种对环境友好的包衣剂配方以替代化学物质是未来研究的重要方向。海藻酸是一种从褐藻等藻类中提取的天然多糖。该材料无毒、可生物降解，易于制备［7］。海藻酸及其衍生盐在农业中的应用较为广泛，主要是作为肥料被广泛用于小麦［8］、水稻［9］、玉米［10］等作物上，能够显著促进作物生长发育、增加产量、改善品质，最终提高经济效益。有研究表明海藻酸可促进种子萌发和幼苗形态建成［11］。鉴于此，本研究以海藻酸为主要成分设计甜玉米包衣剂，通过标准发芽试验、抗氧化酶测定和田间验证等试验确定最佳方案，以期为甜玉米高质量生产提供有效的播前处理技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用甜玉米品种为浙江省推广品种浙甜2088（ZT2088）和浙甜11（ZT11），均购于杭州市临安区绿娃娃种子有限公司。

以海藻酸（上海源叶生物科技有限公司）为主要成分设计三种包衣剂，包衣剂是以功能成分与成膜剂（北京禾泰华生物技术有限公司）按照1∶2.5 的比例组配；以未处理种子为对照。具体成分见表1。吡虫啉、噻虫嗪购于先正达（苏州）作物保护有限公司，MnSO4和6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）购于南京化学试剂股份有限公司。

1.2 仪器与设备

智能光照培养箱，宁波赛福实验仪器厂有限公司；恒温烘箱，上海精宏实验设备有限公司；多功能酶标仪，美国伯腾公司；荧光定量PCR仪，美国伯乐公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准发芽试验 室内发芽试验在人工气候培养箱中进行，严格控制温度和湿度。气候条件设为：昼夜平均温度均为25 ℃，12 h光照（光照强度150 μmol·m-2·s-1）/12 h黑暗交替培养，相对湿度在50%～60%左右。玉米种子平铺在润湿的发芽纸上，卷起后放入自封袋中进行发芽试验。该试验设置3 次重复。每个重复100 颗玉米种子。每天统计萌发种子数（以根达到种子长、芽达到种子长的一半为标准），到第7 天时统计发芽数后剪下幼苗烘干称重，按照公式计算发芽率、发芽势、发芽指数（germination index，GI）和活力指数（vital index，VI）：

式中，Dt 为发芽日数；Gt 为与Dt 相对应的每天发芽种子数。

式中，S 为一定时期内（7 d）幼苗干重（g）；GI 为发芽指数。

1.3.2 抗氧化酶活性及MDA 含量测定 在种子萌发第7 天，取新鲜幼苗液氮冷冻备用，测定SOD、CAT、APX、POD 活性和丙二醛（malonaldehydic acid，MDA）含量，在1 g 冷冻组织中加入提取缓冲液（0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液（pH值7.8）、0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和1% 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）充分研磨。然后将匀浆转移至10 mL离心管中，在4 ℃、10 000 r·min-1下离心15 min，吸取上清液到一个干净的试管中，冰浴备用。SOD 活性通过氯化硝基四氮唑蓝法测定［12］；CAT 活性根据Piechowiak 等［13］的方法进行测定；POD活性采用愈创木酚法测定［14］；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法测定［15］；APX活性采用抗坏血酸法测定［16］。

1.3.3 基因表达量测定 样品处理同上，测定SC3中抗氧化酶相关基因的表达量，以未处理的种子为对照。RNA 的提取使用RNA 提取试剂盒（北京全式金生物技术公司）。使用Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix去除残留基因组并合成cDNA（上海翌圣生物科技有限公司），实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）采用SYBR qPCR 预混液（南京诺唯赞生物科技有限公司），每个样本分3个生物学重复，使用玉米管家基因ZmGAPDH作为内参基因，检测种子抗氧化酶相关基因ZmCAT1、ZmMSD3.4、ZmPOD5、ZmAPX1的相对表达量，具体引物信息见表2。相对表达量采用2-△△CT法计算。

表2 qRT-PCR引物Table 2 Primers for qRT-PCR

1.3.4 田间发芽率、产量及产量构成测定 田间试验设置在浙江农林大学天目山玉米育种基地。试验基地土壤以黄壤和红壤为主，该地交通便利，地理坐标为北纬30°19′～30°93′，东经119°45′～120°92′。年平均气温18.9 ℃，年均降雨量1 613.9 mm，无霜期为324 d 左右。播种前包衣处理采用随机区组设计，每个处理3个重复，小区面积为20 m2。种子于2022年4月7日直播，7月8日收获玉米穗。播种间距为33.3 cm × 60.0 cm，单粒播种，每个小区96 穴。以未处理（CK1）和商品包衣剂噻虫嗪（CK2）为对照。水肥管理遵循当地的习惯和作物需求。播种14 d 后统计田间出苗率。在收获阶段，对玉米产量及产量构成进行测定。

1.4 数据处理与统计分析

百分率数值在进行方差分析前需进行反正弦平方根的转换。采用SPSS 19.0 软件进行处理间差异的方差分析，采用最小显著差异法（least significant difference，LSD）进行显著性检验。应用Origin 2021 软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 包衣处理对甜玉米种子活力的影响

由表3 可知，种子包衣处理可以提高种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。在所用处理中SC3对种子活力的提高效果最明显（图1），SC3 处理较CK1显著提高了ZT2088 和ZT11 种子的各项指标，其中，ZT2088 的发芽势和发芽率较CK1 分别提高11.4 和15.7 个百分点，发芽指数和活力指数分别提高19.1%和53.9%，三个包衣剂处理的发芽势之间无显著差异，SC3 处理的发芽率、发芽指数和活力指数均显著高于SC1 和SC2，但SC1 和SC2 之间无显著差异。SC1 处理可以显著提高ZT2088种子的发芽率、发芽势和活力指数，发芽指数虽未达到显著水平但高于CK1。ZT11 中各指标的变化趋势与ZT2088基本一致。

图1 ZT2088萌发表型Fig.1 Germination phenotype of ZT2088

表3 包衣处理对甜玉米种子活力的影响Table 3 Effect of coating treatment on seed vigor of sweet corn

2.2 包衣处理对甜玉米种子抗氧化酶系统的影响

由表4 可知，种子包衣处理可以提高种子的POD、CAT、SOD 和APX 活性，其中SC3 处理的提高效果整体最明显，SC3处理较CK1整体提高了ZT2088和ZT11种子的抗氧化酶活性。对于ZT2088，经SC3 处理后，POD、CAT、SOD和APX活性较CK1分别提高了74.5%、137.3%、29.5%和42.0%；SC1包衣处理可以显著提高种子的POD、CAT 和APX 活性，相对于CK1 分别提高29.2%、84.7%和23.7%，SOD虽未达到显著水平但高于CK1；SC2处理POD 活性最高，为452.6 U·g-1FW，显著高于其他处理，相对于CK1提高74.5%；包衣处理可有效降低甜玉米种子MDA 含量，SC1、SC2 和SC3 相对于CK1 分别降低23.1%、35.9%和43.6%，SC3 中MDA 含量最低，为2.2 μmol·kg-1FW。ZT11 中各指标的变化趋势与ZT2088基本一致。

表4 包衣处理对甜玉米种子抗氧化酶活性及MDA含量的影响Table 4 Effects of coating treatment on antioxidant enzyme activity and MDA content of sweet corn seeds

由图2可知，ZmAPX1在两个品种的种子中的表达量高于其他基因。ZmMSD3.4在种子中的表达量最低。在ZT2088中，SC3处理种子中ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5的表达量较CK1分别升高55.6%、35.8%、74.7%和31.3%；SC3 处理种子中ZmCAT1的表达量提高幅度最大，ZmPOD5的表达量提高幅度最小。在ZT11 中，SC3 处理种子ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5的表达量较CK1分别升高74.2%、42.5%、57.9%和21.8%，其中ZmAPX1的表达量增加量最高，ZmPOD5的表达量增加量最低。

图2 SC3处理对甜玉米ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5基因表达量的影响Fig.2 Effects of SC3 treatment on the expression levels of ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1 and ZmPOD5 genes in sweet corn

2.3 种子包衣对甜玉米田间出苗、产量及产量构成的影响

由图3可知，甜玉米种子包衣处理可提高种子的田间发芽率。SC3处理ZT11和ZT2088的田间出苗率最高，分别为84.4%、86.5%，相对于CK1和CK2分别提高9.3～11.7和2.8～5.1个百分点。由表5可知，对于ZT2088，SC3 处理的产量最高，为709.0 kg·667 m-2，相对于CK1 和CK2 分别提高7.3%和2.5%；包衣处理与CK2之间无显著差异；SC3 处理穗数最高，为3 133.9，相对于CK1和CK2分别提高7.0%和1.9%，显著高于SC1和SC2。品种中各处理之间单穗重均无显著差异；SC3处理的产量和穗数均最高，且显著高于CK1。

图3 包衣处理对甜玉米种子田间出苗率的的影响Fig.3 Effect of coating treatment on field emergence rate of sweet corn seeds

表5 包衣处理对甜玉米产量及产量构成的影响Table 5 Effects of coating treatment on yield and yield components of sweet corn

3 讨论

3.1 种子包衣对甜玉米种子活力的影响

种子包衣处理可刺激种子的萌发和生长，增强作物对逆境的抗性［17］。使用功能物质包衣可以保护种子免受病原体的影响，同时保障营养供应以促进植物发育［18］。本研究以海藻酸为主要包衣成分对甜玉米种子进行包衣处理，发现经海藻酸包处理后可以提高种子的发芽率、发芽势和活力指数，其中ZT2088 活力指数较CK1提高了28.9%，发芽指数与CK1之间差异不显著。与Afzal等［19］的研究结果类似，即包衣可以改善种子的出苗率。目前已有许多研究表明海藻提取物可以促进种子萌发［20］。如Fu等［21］研究表明，海藻酸盐包衣减少了苜蓿种子和幼苗的细菌携带量；Sarrocco等［22］研究发现，使用海藻酸钠进行种子包衣能提高种子耐贮性和田间出苗率。结合本研究结果，推测海藻提取物对种子萌发的促进作用可能与其含有海藻酸有关。

加入微量元素、植物激素和吡虫啉后种子各项活力指标均有提高，以SC3 效果最好，且显著高于SC1 处理。可能是由于抗病虫害药剂和微量元素的加入提高了种子的田间抗逆能力，种子包衣剂中的抗病虫药剂和营养物质会直接释放到种子周边土壤中，可有效防止种传病害和土传病害的传播，同时提供营养物质，保障植株的生长和发育［23］。相关研究表明，简单的营养物质包衣对种子的活力改善不明显，但与杀菌剂联合使用后可达到显著效果［24］。可见，多种功能成分的共同作用对种子活力的提高要显著高于单一成分的使用，后续研究中可增加其他功能物质以验证各种成分之间的协同作用对种衣剂作用效果的影响，最终形成更为高效、环保的种子包衣剂。

3.2 种子包衣对甜玉米种子抗氧化酶系统的影响

针对种子活力的影响因素研究较多，目前认为ROS 是影响种子活力形成和保持的重要因素［2］。本研究测定了以海藻酸为主的甜玉米包衣处理后种子中的抗氧化酶活性，研究发现SC1 处理有效提高了POD、CAT、APX 的活性，SC2 的POD 活性最高；SC2、SC3 的SOD、CAT 和APX 活性较高，均显著高于对照处理。Fang 等［25］的研究同样表明包衣剂能够提高植物抗氧化酶的活性，增强幼苗根系的活性。李防洲等［26］研究表明，种子包衣处理增加了SOD、CAT 和POD 活性，降低了低温胁迫下植物细胞中ROS 水平。MDA 是脂质过氧化产物，会损伤生物膜结构，抑制其正常功能［27］。种子中MDA 的含量在一定程度上反映了种子脂质过氧化程度。本研究表明，SC3 处理后ZT2088 种子中MDA 含量相对CK1 显著降低43.6%。说明SC3 处理后种子膜脂过氧化程度较低，有利于保持种子活力。在SC3 处理下，与抗氧化能力有关的基因ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1、ZmPOD5的表达量增加，且与酶活性数据吻合，说明该处理通过调节基因表达来调节植物的生长发育以及防御机制。前人研究表明，与抗氧化酶相关的基因ZmAPX1［28］、ZmMSD3.4［29］、ZmCAT1［30］、ZmPOD5［31］表达量升高会进一步提高APX、SOD、CAT、POD 活性，减少细胞内ROS 含量，增强植物抗逆能力，与本研究结果一致。综上，增加抗氧化酶活性是SC3 处理提高甜玉米种子活力的重要因素。

3.3 包衣处理对甜玉米田间发芽率、产量及其构成的影响

种子包衣是在种子中形成一层含有特定功能成分（如杀虫剂、生物和微量营养素）的包膜，本研究使用组合包衣剂可有效提高种子田间发芽率，以SC3 效果最好，显著高于CK1，高于CK2 但未达到显著差异。SC3的产量显著高于对照。种子包衣处理对单穗重影响较小，但对每亩穗数影响较大，SC3 较CK1 显著提高了甜玉米的穗数。Dawid 等［32］研究发现海藻酸复合包衣可刺激玉米的早期生长，从而提高作物产量，与本研究结果相似。Szparaga［33］研究发现，包衣处理可显著增加大豆的产量（提高10%以上）和产量构成（单株荚数、每荚粒数）。此外，包衣处理在水稻等作物中同样具有较好的应用效果［34］。综上所述，种子包衣处理在多种作物上均取得良好效果。因此，结合海藻酸理化性质、生物活性与本研究结果，进一步研究以海藻酸为主的配套栽培措施具有重要实践意义。

4 结论

本研究表明，SC3（海藻酸、硫酸锰、6-BA 和吡虫啉）包衣处理可以提高甜玉米种子活力，使得甜玉米的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均有一定程度提高。同时大田试验表明，包衣处理可有效提高甜玉米的田间出苗率，且ZT2088 的SC3 田间出苗率比商用包衣剂高出6.4%，SC3 处理甜玉米产量（鲜重）显著高于CK1。包衣处理可提高甜玉米种子中抗氧化酶活性（POD、SOD、CAT 和APX），同时提高种子中抗氧化酶相关基因的表达。SC3 对种子活力的提高可能与较高的抗氧化酶活性有关，同时良好的幼苗建成为产量提高提供了前提条件。