平眩方对椎动脉型颈椎病模型SD 大鼠的治疗作用及机制研究

王怡璇 彭 楠 肖晶晶 李腾龙▲ 李 璐

1.湖南中医药大学第二附属医院骨伤一科，湖南长沙 410005；2.成都市双流区第一人民医院中医骨伤科，四川成都 610200

椎动脉型颈椎病（cervical spondylotic arteriopathy，CSA）是颈椎病常见分型之一，是指眩晕与颈部疼痛症状相关联的一种临床综合征[1-3]。CSA 患者被颈部疼痛及阵发性眩晕困扰，极大地影响了患者的生活质量[4-5]。近年来，CSA 的发病率逐年攀升、发病人群逐渐年轻化[6]，找到治疗CSA 的有效方法成为亟待解决的临床问题。中医对于颈椎病的治疗独具特色，CSA 在中医隶属于“眩晕”范畴。平眩方是治疗CSA 的经验方，经过临床反复使用和验证，疗效安全、稳定，患者反馈良好[7-10]。为了进一步探索平眩方治疗CSA 的作用机制，本研究探讨平眩方对于CSA 模型大鼠椎动脉血流情况、血液流变学、血浆内皮素（endothelin，ET）及血清一氧化氮（nitric oxide，NO）水平、椎动脉血管壁中膜厚度的影响。

1 对象与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠60 只（雌雄各半），8 周龄，体重（200±20）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。在室温（25±1）℃、湿度45%～50%的条件下饲养。动物许可证号：SYXK（湘）2019-0009，动物生产合格证号：430727221100472812。实验已获得湖南中医药大学动物伦理委员会批准（LL2022022304）。

1.2 实验药物

消痔灵注射液（国药准字：Z22026175，吉林省集安益盛药业股份有限公司），氟桂利嗪胶囊（国药准字：KKJ0QH5，西安杨森制药有限公司）。平眩方的制备：半夏、天麻、黄芪、当归、钩藤、白术、茯苓、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙、甘草的质量比为1∶3∶6∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1∶1（湖南中医药大学第二附属医院中药房提供），加入药物总质量的10 倍量蒸馏水提取2 h，过滤保留滤液，滤渣加入药物开始总质量的8 倍量蒸馏水操作同前，将两次滤液合并，旋转蒸发浓缩至2 g/ml，-20℃保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

NO 硝酸还原酶法试剂盒（货号：FY40104-A，江苏菲亚生物科技有限公司）；ET 放射免疫法试剂盒（货号：FY3509-A，江苏菲亚生物科技有限公司）；苏木精-水溶性伊红染色液（货号：BA4025，武汉贝索生物技术有限公司）；中性树胶（货号：10004160，中国医药集团有限公司）。彩色多普勒超声诊断仪（型号：D350-VET，飞依诺科技股份有限公司）；全自动血流变测试仪（型号：ZL9100，北京众驰自动化设备有限公司）；脱水机（Donatello，湖南迪佩斯智能科技有限公司）；包埋机（型号：JB-P5，武汉俊杰实业集团有限公司）；病理切片机（型号：RM2016，上海徕卡仪器有限公司）；组织摊片机（型号：KD-P，浙江科迪集团有限公司）；显微镜（型号：E100，尼康）。

1.4 实验分组及处理

60 只大鼠适应性喂养1 周，按照随机数字表法分为6 组：正常组，模型组，氟桂利嗪组，平眩方低、中、高剂量组，每组各10 只。除正常组外，其他组均进行造模处理。

采用改良注射硬化剂法[11-13]制作CSA 大鼠模型：腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，将大鼠放置呈右侧卧位，从左侧肱骨头上缘垂直颈椎进针注射5 ml/kg 消痔灵注射液于大鼠左侧第3～5 颈椎横突孔周围肌肉，1 周后重复注射。

造模4 周后大鼠灌胃给药，根据人与大鼠体表面积折算法[14]计算各组给药剂量。氟桂利嗪组给予0.9 mg/kg 氟桂利嗪胶囊（相当于成人剂量10 mg/d，用0.9%NaCl 配成0.1 mg/ml），平眩方中剂量组给予15.6 g/kg 平眩方浓缩液（临床有效剂量，相当于成人剂量130 g/d），平眩方低、高剂量组分别予7.80、31.2 g/kg平眩方浓缩液，正常组及模型组不予治疗。连续给药2 周，1 次/d。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 大鼠椎动脉经颅多普勒超声（transcranial doppler，TCD）检测 末次给药后，所有大鼠禁食禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，枕后及颈部备皮，TCD 测定左侧椎动脉平均血流速度（mean velocity，Vm）、搏动指数（pulsation index，PI）、阻力指数（resistance index，RI）。

1.5.2 大鼠血液流变学及血浆NO、血清ET 表达的检测末次给药后，所有大鼠禁食禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，下腔静脉取血5 ml，置肝素管进行全血黏度[低（1/s）、中（5/s、30/s）、高（200/s）切变率下检测]、全血低/高切相对指数和红细胞聚集指数测定；全血经25℃、3 000 r/min离心10 min，取血浆测定血浆黏度，所有样本在4 h 内检测完毕。另取1 ml全血于普通管静置30 min 后，样品离心取上层血清（4℃，离心半径8 cm，3 000 r/min，10 min），按试剂盒说明书检测血清中NO 水平；另取1 ml 全血于肝素管中混匀30 min 后，样品离心分离上层血浆（4℃，离心半径8 cm，3 000 r/min，30 min），按试剂盒说明书检测血浆中ET 水平。

1.5.3 大鼠椎动脉血管壁中膜厚度的检测 取大鼠左侧椎动脉3～5 mm 组织，4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，显微镜下观测血管壁中膜厚度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 27.0 统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较均采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠左侧椎动脉血流TCD 检测

与正常组比较，模型组左侧椎动脉Vm 降低，PI与RI 升高（P＜0.05）；与模型组比较，平眩方中、高剂量组左侧椎动脉Vm 升高，PI 与RI 降低（P＜0.05）；与平眩方低剂量组比较，平眩方中、高剂量组的左侧椎动脉Vm 升高，PI 与RI 降低（P＜0.05）。见图1。

2.2 各组血液流变学指标比较

与正常组比较，模型组低、中、高各切变率下的全血黏度，血浆黏度、全血高/低切相对指数、红细胞聚集指数均升高（P＜0.05）；与模型组比较，平眩方中、高剂量组血液流变学各指标均降低（P＜0.05）；与平眩方低剂量组比较，平眩方中、高剂量组血液流变学各指标均降低（P＜0.05）。见图2～3。

图2 各组大鼠全血黏度比较（n=10）

图3 各组大鼠血浆黏度、全血高/低切指数、红细胞聚集指数比较（n=10）

2.3 各组血浆ET、血清NO 含量比较

与正常组比较，模型组血浆ET 水平升高，血清NO水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，平眩方中、高剂量组血浆ET 水平降低，血清NO 水平升高（P＜0.05）；与平眩方低剂量组比较，平眩方中、高剂量组血浆ET水平降低，血清NO 水平升高（P＜0.05）。见图4。

图4 各组大鼠NO、ET 检测结果（n=10）

2.4 各组血管壁中膜厚度比较

与正常组比较，模型组椎动脉血管壁中膜平滑肌细胞肥大增生明显，血管壁中膜厚度增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，平眩方中、高剂量组血管壁中膜平滑肌细胞肥大增生明显受到抑制，血管壁中膜厚度降低（P＜0.05）；与平眩方低剂量组比较，平眩方中、高剂量组血管壁中膜厚度降低（P＜0.05）。见图5、表1。

图5 各组大鼠椎动脉切片（HE 染色，200×）

表5 各组大鼠椎动脉血管壁中膜厚度比较（μm，）

表5 各组大鼠椎动脉血管壁中膜厚度比较（μm，）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与平眩方低剂量组比较，cP＜0.05。

3 讨论

CSA 是骨科的常见病，因颈椎内外结构的平衡被破坏，导致椎动脉受压引起眩晕、目眩及视物模糊等一系列临床表现，影响患者的生活工作，造成严重的经济负担和心理压力[2-5]。随着CSA 的深入研究，改善血液流变学指标、缓解椎动脉血管痉挛是目前治疗的主要思路、中医药治疗从整体观念、辨证论治的角度出发，为CSA 的治疗带来了新的可能、平眩方临床效果显著，全方具有化痰熄风、活血通络之功，使痰散瘀消、血脉通行、眩止痛缓。本研究使用平眩方干预治疗CSA 大鼠模型探讨平眩方治疗CSA 可能存在的作用机制。

脑供血不足是CSA 常见的病理变化，其根本原因在于椎动脉受压，使血流速度减慢，颈椎局部炎症刺激椎动脉痉挛，进而导致椎-基底动脉供血不足，脑部因缺氧而眩晕[15-16]。通过TCD 检测椎动脉的血流变化，可以评估脑供血不足的程度及恢复情况。研究证实，CSA 发病与血液流变学波动呈正相关[17-18]。发病期间CSA 患者的血液流变学各指标明显升高，细胞聚集性增高，血液处于高黏状态，血流速度减慢，导致脑部供血减少[19]。ET 是由血管内皮细胞分泌的生物活性多肽，能收缩血管[20-21]，NO 能抑制ET 的缩血管作用，可使内皮下血管平滑肌细胞处于增殖静止状态而达到抗血管壁增殖的作用[22-23]。长期由炎症引起的氧化应激反应可能会引起椎动脉血管平滑肌细胞肥大、增殖，进而引发血管重构[24]。血管壁中膜厚度是确定血管重构的重要指标之一[24-25]。本研究将TCD 检测血流变化、血液流变学指标、血清NO、血浆ET 和血管壁中膜厚度作为观察指标。

本研究结果显示，平眩方中、高剂量干预CSA 大鼠模型后，能够升高椎动脉Vm，降低Pi 与RI，提示平眩方能够改善椎动脉的血流情况；平眩方中、高剂量组各切变率下的血浆黏度，全血高、低切指数及红细胞聚集指数显著降低，提示平眩方在改善血液流变学、稀释血液黏度、维持红细胞形变稳定方面具有积极作用；平眩方中、高剂量组能够降低ET 水平、增加NO 水平、抑制椎动脉血管壁中膜增厚，提示平眩方能够通过调节ET 与NO 的平衡关系，从而改善椎动脉痉挛、减少局部炎症的产生，进一步抑制平滑肌细胞增殖，抑制血管损伤及重构、红细胞变形性受许多因素影响。目前有关红细胞变形性及血管重构与CSA 的相关研究较少，未来可以进一步研究。

综上所述，CSA 的发病机制可能与血管收缩舒张功能失调、血流动力和血液流变学指标异常、椎动脉增殖重构等相关。