棉类纺织品文物霉变菌株的分离与鉴定

曾祥鹤

(开封大学艺术设计学院,河南开封 475000)

0 引 言

纺织品文物作为我国文化遗产的重要组成部分,是古代文明的载体之一,也是我国文化软实力的重要代表。纺织品文物通常是由蚕丝、棉麻、葛布等天然材料织造而成,在掩埋、挖掘以及保存的过程中易受侵蚀细菌、软腐真菌和腐生真菌等微生物的侵蚀和降解[1]。霉菌对纺织品的危害是持久的、多样的,霉菌能够将含有碳、硫等营养源的棉、毛和丝纤维分解为养分,促进自身快速繁殖和生长;同时霉菌分泌有机酸和色素对文物造成酸蚀、颜色污染,甚至造成腐烂和降解等危害[2],并且霉菌具有顽强的生命力,有的能持续几十年的休眠期。目前留存在世的纺织品文物服饰通常是从棺椁、土壤中发掘,有研究表明埋藏于地下的服饰类文物微生物降解主要来自侵蚀细菌和软腐真菌,在纺织品文物中至今已发现30余属200多种霉菌[3-4];博物馆中常见的霉菌有根霉菌、曲霉菌、球毛壳菌、青霉菌等,纺织品文物相较于瓷器文物、木质文物、金属文物等更容易受到腐蚀[5]。陶娅妃[6]对纺织物上霉变微生物进行分离鉴定,共得到三种致霉菌,分别为曲霉属、青霉属和根霉属。王毅婧[7]对真丝文物上的霉变微生物进行分离鉴定,共得到三种致霉菌孢霉属、曲霉属和芽枝霉属。纺织品文物又因其材质、染料、颜料、性质等因素,在馆藏过程中易受外界环境影响[8]。因此,对纺织品文物上的真菌进行分离鉴定,确定致霉优势菌属,根据其生长规律和生理生化特性,为纺织品文物开发长效防霉技术靶标菌株[9-10],对文物保护具有重要意义。目前对纺织品霉变菌株的研究多利用生物技术手段对霉变菌株进行分离纯化、形态学鉴定以及生物学鉴定,从而确定致霉优势菌属,为文物的清洗、修复、保存奠定理论基础[11-12]。

本研究从已发生霉变的棉类纺织品文物上的酶菌斑块提取霉菌,利用PDA培养基分离纯化,得到了单一的菌株,再采用显微形态学观察与18S rDNA-ITS序列分析相结合的方法对霉变微生物进行鉴定[13-16],确定致霉优势菌属,为纺织品文物的博物馆防霉保护工作以及抗霉材料的开发提供理论依据。

1 样品和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1霉变织物 本次实验所采集的霉菌来自河南省开封市汴绣私人博物馆中一件表面明显发生霉变的棉织物文物(图1),据记载该文物属于晚清年间,文物常年保存在室内温度23～25 ℃,相对湿度65%～70%之间的环境中。通过对织造组织以及毛边显微镜观察分析可知该文物是棉织物。霉菌附着在纺织品文物表面,成散落状,服装对襟领口处霉斑较为明显,暂无侵蚀织物内部结构迹象。

图1 霉变纺织品文物Fig.1 Mildewed textile relics

1.1.2试剂 PDA培养基:马铃薯切块200 g,煮沸20～30 min,过滤,滤液加入葡萄糖20 g,琼脂15 g,蒸馏水定容至1 L。液体培养基与固体培养基成分和配制方法相同,不加琼脂。以上培养基经过高压灭菌后使用。引物采用真菌通用引物(表1),由上海生物工程有限公司合成。Taq PCR Master Mix试剂盒购自上海生物工程有限公司;Agarose LE购自河南东格生物技术有限公司;真菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.1.3仪器 超净工作台:苏州苏洁净化设备股份有限公司;振荡培养箱:上海智诚科学仪器公司;可见分光光度计:海精密科学仪器有限公司;灭菌锅:上海申安医疗器械厂;显微镜:Nikon;凝胶成像系统:东胜有限公司。

1.2 方法

1.2.1霉变菌株采集、分离、纯化 用无菌棉签轻轻擦拭汴绣文物表面霉斑部位,轻轻涂在PDA培养基平板中,于28 ℃培养箱中恒温培养5～7 d形成菌落[17]。挑选菌落,在新的PDA培养基平板中划线,继续培养。5～7 d后选择菌落形态典型、分离效果明显的平板,分别挑取单菌落边缘的菌丝,转接到新的PDA培养基平板上继续培养,经此方法3次纯化后获得单菌落菌株。

1.2.2形态学鉴定 利用无菌接种环挑取少量纯化后的菌落菌丝,在PDA培养基平板中间点植接种。于28 ℃霉菌培养箱中恒温培养5～7 d形成菌落,观察菌落的生长情况和形态特征,并拍照,按照《真菌鉴定手册》对分离得到的霉菌进行初步鉴定[18]。利用乳酸石炭酸染料对菌丝进行染色,观察显微结构并拍照。

1.2.3霉菌DNA提取 取纯化过的菌落或菌丝接种于PDA液体培养基中,于28 ℃条件下于摇床震荡培养3 d。收集1～2 mL菌液,离心弃上清。根据试剂盒说明书对霉菌DNA进行提取。

1.2.4分子生物学鉴定 扩增真菌ITS序列,使用通用引物ITS1和ITS4。PCR反应体系以及条件如表2所示。PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶检测,观察条带形状。同时委托上海生工公司对其进行序列测定。将测序结果提交至NCBI核酸序列数据库中进行BLAST分析对比,使用Mega7软件构建系统发育树。

表2 PCR反应体系以及反应条件Table 2 PCR reaction system and reaction conditions

2 结果和讨论

2.1 分离纯化结果

通过分离纯化获得6株霉菌。依次编号为A、B、C、D、E、F(图2)。

图2 霉菌菌落形态与显微形态(100×)Fig.2 Mold colony morphology and microscopic morphology (100×)

2.2 形态观察结果

菌株A:生长速度缓慢,28 ℃培养7 d菌落直径约25～40 mm,菌落呈绒毛状,初期呈白色,后变为绿褐色,但边缘呈白色,PDA培养基中未见菌丝,但在液体PDA培养基中有菌丝,且呈白色。反面观呈淡黄色。显微结果发现,菌丝较长,分生孢子梗在顶端分枝产生小梗如帚状,偶有单论生或不规则者,孢子多数呈双胞,呈球形或卵圆形,壁光滑,分生孢子链疏松不规则。

菌株B:生长速度比较缓慢,28 ℃培养7 d菌落直径约25～30 mm菌落初期呈白色,后期呈绿色,边缘为白色,未见菌丝。反面观呈淡黄色。显微结果发现,菌丝细长,菌丝上有较多散落的孢子,大多数为单孢且易脱落,有些孢子聚团形成孢囊,呈圆盘状。分子孢子梗发生于基质,梗基紧凑,瓶梗呈柱状。

菌株C:生长速度较快,28 ℃培养5 d菌落直径约25～40 mm,菌落呈绒毛状,初期呈白色,后期变为墨绿色,中央凹陷,颜色较深;反面观中央呈墨绿色,边缘呈白色。显微结构发现,菌丝细长,上面有较多散落的孢子,菌丝不易被乳酸石炭酸棉蓝色染液染色,呈淡黄色,孢梗茎呈褐色,表面光滑,分生孢子呈圆形或椭圆形,灰褐色。

菌株D:生长速度适中,28 ℃培养6 d菌落直径达30～40 mm菌落呈菊花心样结构,中央呈绿色,边缘呈白色,带有放射性沟纹。初期为黄色,中期变为黄绿色,最后颜色变淡,反面观呈淡黄色。显微结构发现,菌丝较短,分生孢子梗无横隔,梗的定端形成球状膨胀形成顶囊,上面附着许多分生孢子。

菌株E:生长速度较快,28 ℃培养5 d菌落直径约40～50 mm,菌丝体较长、呈白色,绒状、纤细、具隔膜,中央凸起,呈辐射状向周围生长。背面观中央呈红色,其余为白色。显微结构发现,菌丝分叉较多,孢子较小呈纺锤形,附着在菌丝上,菌核形状多为球形,单生或丛生。

菌株F:生长速度较快,28 ℃培养5 d菌落直径约60～80 mm,菌落呈绒毛状,菌丝较长呈灰白色,中央凸菌丝较少,呈墨绿色;反面观,呈墨绿色,边缘呈白色。显微结构发现,菌丝细长成簇,孢子梗较短,单生或丛生,大多不分枝,分生孢子较长呈淡褐色附着在菌丝上,呈纺锤状或倒棒状,顶端呈喙状,成链生长。

2.3 分子生物学鉴定结果

2.3.11.0%的琼脂糖凝胶检测 按照试剂盒说明书,提取菌株基因组DNA按照上述条件对ITS基因片段进行PCR扩增,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果发现,ITS基因片段的PCR扩增产物在500 bp到750 bp之间有特异性扩增条带,大小与预期值相符。

2.3.2测序结果 根据生工公司(上海)测序结果,将得到的基因序列与NCBI核酸序列数据库中收录的基因序列进行同源性比对,选取数据库中得分最高的序列作为参比对象,测序比对结果见表3。菌株A和菌株B与青霉菌属(Penicillium)霉菌同源性高达92%,但是菌株A和菌株B的18S rDNA-ITS序列有所差异,因此猜测菌株A和菌株B为同属不同种,初步断定为青霉菌属;菌株C和菌株F与交链孢霉属(Alternaria)霉菌同源性分别为99%和98%,但是菌株C和菌株F的18S rDNA-ITS序列有所差异,因此猜测菌株C和菌株F为同属不同种,初步断定为交链孢霉属;而菌株D与曲霉属(Aspergillus)霉菌同源性高达98%,初步断定为曲霉属;菌株E与镰刀菌属(Fusarium)霉菌的同源性高达100%,初步断定为镰刀菌属。

表3 霉变微生物的18S rDNA-ITS序列分析Table 3 Sequence analysis of 18S rDNA-ITS in molds

在Mega7.0中构建6种霉菌18S rDNA-ITS序列的统进化树。系统进化树的自展值均超过50,表明构建的系统进化树可信。根据系统发育树分析结果,菌株A和菌株B与草酸青霉在一个分支,均为青霉属;菌株C与链格孢霉在一个分支,均为交链孢霉属;菌株D与米曲菌在一个分支,为曲霉属;菌株E与赤霉菌在一个分支,为镰刀菌属;菌株F与交链孢霉在一个分支,为交链孢霉属。通过以上分析得出,菌株A和菌株B为青霉属,菌株C和菌株F为交链孢霉属,而菌株D为曲霉属,菌株E为镰刀属,但以上6种菌株无法确定到种。

2.4 讨论

针对本研究鉴定出的霉菌种类与其生存特征,对后期博物馆贮藏棉类纺织品文物提出以下建议:博物馆在保存纺织品文物时应注意环境卫生,可选用防霉建筑材料,做到空气净化,文物入库与出库均需要经过消毒处理,库房还可通过熏蒸的方式进行环境消毒;微生物适宜生存的温度为25～37 ℃,相对湿度为80%～90%,因此博物馆可通过控制环境温度、湿度降低霉菌活性;博物馆还可通过放置霉敌、灭霉净、邻位苯基苯酚钠等防霉剂抑制霉菌的生命活动。

目前国内多家单位均进行了博物馆防霉、杀虫等技术研究,通过抑菌实验,测量各类试剂抑菌程度。然而各类防霉剂是否对纺织品文物直接或间接产生损害还需进一步的研究,单纯的抑菌实验只能判断药剂是否抑菌,却不一定能应用于实际当中。如植物提取精油虽能有效抑菌,但会影响纺织品面料表面色泽,给文物保护带来不可逆转的损害。肖雨嫣[19]等对霉变棉织物上的霉菌进行了抑菌实验,采用山梨酸钾、硫酸锌和苯甲酸钠作为抑菌剂,虽证明此类试剂对霉菌的抑制作用,但无法排除此类试剂对棉类纺织品文物的伤害,因此,纺织品文物抑菌实验的实现与突破,需要生物技术手段、文物复制技术等多方面努力。根据不同菌属的生长习性和纺织品文物特性,有针对性地开发防霉剂以及选择合适的储存条件,对纺织类文物的保护具有重要意义。

3 结 论

本研究选取已产生霉变的棉类纺织品文物衣襟上的霉株,利用PDA培养基分离纯化共得到6种不同形态的霉菌。通过对6种霉菌基因组DNA的ITS区扩增测序,同时与NCBI核酸数据库中已知菌种序列对比以及构建系统发育树,鉴定结果显示,2种为青霉属、2种为交链孢霉属、1种为曲霉属、1种为镰刀属,但无法鉴定到种。通过上述实验发现,该件棉类纺织品文物霉变菌属分别为青霉菌属、交链孢霉属、曲霉属、镰刀属,霉菌的产生原因暂时不明,人体皮脂污染、穿着污染、保存环境等均会对文物的侵蚀产生一定的影响。