新疆褐牛PPARγ、MYF5和AGPAT5基因SNP突变与体尺性状的关联分析

韩丽云,李艳艳,马 云,虎红红,康小龙,郭殿芝,史远刚

(1.宁夏大学农学院,银川 750021;2.宁夏农垦贺兰山奶业有限公司,银川 750021)

0 引 言

【研究意义】新疆褐牛是我国自主培育的乳肉兼用型地方牛种,具有耐寒耐热的特性,分布于我国新疆伊犁、阿勒泰、塔城、昌吉、哈密和南疆等地。研究新疆褐牛体尺性状基因,关联关系对新疆褐牛的育种有实际意义。【前人研究进展】过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)家族是一系列转录调节因子的总称,在脂质代谢、胰岛素信号通路、葡萄糖代谢和脂肪细胞分化过程中发挥着重要作用[1]。PPARs涵盖了三种亚型,包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ;其中,PPARγ是一种多功能的蛋白质,具有脂肪专一性[2],保障脂肪组织能量始终处于稳定状态,并调控多种基因表达,参与脂肪细胞分化和脂代谢[3]。MYF5属于MRFs(Myogenic factors)转录因子家族,MRFs家族包括MyoD、MyoG、MYF5和MYF6[4],MRFs家族成员均含有螺旋-环-螺旋结构域结构,可以识别并结合E-box[5]。MYF5蛋白在哺乳动物中高度保守,是调节骨骼肌前体分化的转录因子级联中的第一个,在骨骼肌生长、发育分化[6]中发挥重要作用,可以影响畜禽的产肉[7]、肉质和风味[8]等。磷酸甘油酰基转移酶(1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferase,AGPAT)可以有效优化三酰甘油,进而促进合成,属于重要的关键酶[9,10]。【本研究切入点】目前共发现11种AGPAT的亚型;除拟南芥外,AGPAT在所有物种中都具有高度的保守性[11]。AGPAT与牛的出栏重、宰前重、胴体重和净肉重均存在显著相关[12],参与脂肪酸氧化、生物合成和脂肪储存等[13]。需研究鉴定与牛体尺性状相关的基因。【拟解决的关键问题】筛选PPARγ、MYF5和AGPAT5基因的6个SNP位点,在褐牛群体中进行基因型分型,并进行SNP水平和单倍型水平的关联分析及生物信息学分析,研究基因PPARγ、MYF5和AGPAT5与牛性状的关系,为新疆褐牛的分子育种提供标记信息。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验群体由54头新疆褐牛公牛和45头新疆褐牛阉牛组成,试验牛均饲养在新疆塔城地区。试验牛12月龄时,采集每头试验牛的尾根静脉血样10 mL,随后将样本置于-20℃条件下保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 测 量

试验牛10～16月龄间,测量每头试验牛空腹状态下的十字部高、胸宽、胸围、体长和体重等性状[14]。

1.2.2 血液DNA提取

使用DNA试剂盒提取试验牛的基因组DNA,采用Nanodrop-2000型核酸分析仪检测DNA样品的纯度和浓度。

1.2.3 引物设计

利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)得到牛PPARγ,MYF5和AGPAT5的基因序列,并采用PremierPrimer5.0和Oligo6.0软件对基因的目标区域进行引物设计,引物由武汉华联科生物技术有限公司合成。表1

表1 引物序列

1.2.4MYF5、PPARγ和AGPAT5目标片段扩增及测序

1.2.5 PCR产物酶切处理

采用1.5%凝胶将4μL PCR扩增产物进行凝胶电泳(80V条件下电泳30 min),37℃完成水浴处理,时间为16 h。在PCR中完成扩增处理,其质量为8.0 μL。在限制性条件下,完成内切酶0.5 μL的处理,以及配置10×New EnglandBiolabs公司酶缓冲液,体积为2.0 μL,最后配置9.5 μL的双蒸水。

取8 μL酶切产物用2%凝胶进行凝胶电泳,80V条件下电泳15 min,在120V环境中完成电泳处理,时间为15 min,通过凝胶成像仪完成观察,并且将最终的结果实施测序处理。

1.3 数据处理

通过DNAMAN、Chromas进行序列的比对分析,并且使用PIC软件PIC,基因型频率等。使用SAS 8.0软件单因素方差分析相关性。

使用RNA fold web server网站预测mRNA的二级结构,使用PredictProtein软件确定蛋白质二级结构。对于染色体的定位,使用MapGene2Chromosome v2完成预期判断。基于SNP的连锁不平衡情况,使用Haploview4.2构建单倍型。

2 结果与分析

2.1 新疆褐牛PPARγ、MYF5和AGPAT5基因部分外显子与内含子扩增

研究表明,目标基因PPARγ、MYF5和AGPAT5的6个片段扩增产物长度与目的基因大小相符,特异性良好。图1

注:M代表Marker,P1代表PPARγ-exon7,P2表示PPARγ-intron2,P3表示MYF5-exon1,P4表示MYF5-intron1,P5表示AGPAT5-exon7,P6表示AGPAT5-intron3。

2.2 PPARγ基因PCR-RFLP分析

2.2.1 PPARγ-exon7突变

研究表明,PPARγ-exon7的扩增片段大小为417 bp,经酶切分型发现突变位点存在2种基因型,即AA型和AB型,并将为SNP1。exon7-74 bp存在突变,测序和酶切分型的结果可以互相印证。图2,图3

图2 PPARγ-exon7-74测序结果

图3 PPARγ-extron7的PCR-RFLP电泳结果

2.2.2 PPARγ-intron2突变

研究表明,PPARγ-intron2的扩增片段大小为1 090 bp,经酶切分型发现突变位点存在3种基因型,即AA型、AB型和BB型,并将为SNP2。PPARγ-intron2存在2个突变位点,分别在intron2-133 bp(G/C)和intron2-170 bp(C/T),测序与酶切分型的结果可以互相印证。图4,图5

图4 PPARγ-intron2的测序结果

图5 PPARγ-intron2的PCR-RFLP电泳结果

2.3 MYF5基因PCR-RFLP分析

2.3.1 MYF5-exon1突变

研究表明,MYF5-exon1扩增片段大小为666 bp,经酶切分型发现突变位点存在2种基因型,即AA型和AB型,并将为SNP3。MYF5-exon1存在1个突变位点,为exon1-236 bp(T/C)。测序结果与酶切的分型结果一致。图6,图7

图6 MYF5-外显子1的测序结果

图7 MYF5-外显子1的PCR-RFLP电泳结果

2.3.2 MYF5-intron1突变

研究表明,MYF5-intron1扩增片段大小为897 bp,突变位点存在2种基因型,即AA型和AB型,并将此处定为SNP4。MYF5-intron1存在1个突变位点,为intron1-633 bp(A/G)。测序结果与酶切的分型结果一致。图8、图9

图8 MYF5-内含子1的测序结果

图9 MYF5-内含子1的PCR-RFLP电泳结果

2.4 AGPAT5基因PCR-RFLP分析

2.4.1 AGPAT5-intron3突变

研究表明,AGPAT5-intron3扩增片段大小为997 bp,经酶切分型发现突变位点存在3种基因型,即AA型、AB型和BB型,并将定为SNP5。AGPAT5-intron3存在3个突变位点,分别为intron3-501 bp(G/C)、intron3-515 bp(G/T)和intron3-550 bp(G/T)。测序结果与酶切的分型结果一致。图10、图11

图10 AGPAT5-内含子3的测序结果

图11 AGPAT5-内含子3的PCR-RFLP电泳结果

2.4.2 AGPAT5-exon7突变

研究表明,AGPAT5-exon7扩增片段大小为724 bp,经突变位点存在3种基因型,即AA型、AB型和BB型,并将为SNP6。AGPAT5-exon7存在2个突变位点,分别为AGPAT5-exon7-72 bp(G/A)和AGPAT5-exon7-97 bp(A/G)。测序结果与酶切的分型结果一致。图12、图13

图12 AGPAT5-外显子7的测序结果

图13 AGPAT5-外显子7的PCR-RFLP电泳结果

2.5 基因型频率、2检验以及等位基因频率

研究表明,6个SNP位点中,共有4个SNP位点处于哈代-温伯格平衡(P> 0.05)SNP4和SNP6偏离了哈代-温伯格平衡(P< 0.05)。在SNP1、SNP2、SNP3和SNP6中,AA型为优势基因型,基因型频率分别为0.85、0.51、0.96和0.73;AB优势基因型,基因频率分别为0.760.55。位点SNP1、SNP3的PIC小于0.25,为低度多态;位点SNP2、SNP4、SNP5和SNP6的PIC值处于0.25～0.5,为中度多态。表2

表2 6个SNPs位点基因频率、基因型频率以及检验

2.6 突变位点与体尺性状关联性

研究表明,SNP1位点不同基因型的个体之间,胸围和体重有极显著差异(P<0.01),AA型个体的胸围和体重均极显著低于AB型(P< 0.01)。SNP2位点不同基因型的个体之间,体重存在极显著差异,AB型个体的体重极显著高于AA和BB型个体(P< 0.01)。SNP3没有显著差异。SNP4位点中,不同基因型的个体之间,胸宽有显著差异,AA型个体胸宽显著低于AB型个体。SNP5位点不同基因型的个体之间,体长、胸围、胸宽体重有显著差异,AB型个体体长显著低于BB型个体(P<0.05),AA和AB型个体胸围、胸宽体重显著高于BB型个体(P<0.01)。SNP6位点中,不同基因型之间,胸围、胸宽均有显著差异,AA型和AB型个体胸围显著高于BB型个体(P<0.01),AA和BB型个体胸宽极显著低于AB型个体(P<0.01)。表3

表3 目标基因6个SNPs位点与体尺性状的关联(最小二乘均值±标准误)

2.7 与体尺性状

2.7.1 PPARγ-exon7(74)-intron2(133、170)

研究表明,基于连锁不平衡,PPARγ-exon7(74)-intron2(133、170)构建了一个单倍型块,共包含5种单倍型,GGC为优势单倍型(0.417 7)。该单倍型块对胸宽和十字步高分别有极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)的影响。GCT型个体的胸宽极显著小于GCC、GGT和TCT型(P<0.01),显著小于GGC型个体(P<0.05);TCT型个体的十字部高显著低于GCT和GCC型(P<0.05)。表4

表4 PPARγ-exon7(74)-intron2(133、170)与体尺性状的关联(最小二乘均值±标准误)

2.7.2 MYF5-exon1(236)-intron1(633)分析

研究表明,基于连锁不平衡,MYF5-exon1(236)-intron1(633)构建了一个单倍型块,共包含3种单倍型,TG为优势单倍型(0.725 2)。该单倍型块对体长和胸宽有显著影响(P<0.05)对胸围、十字部高和体重有极显著影响(P<0.01)。CG型个体的体长显著高于TG型(P<0.05),胸围和体重极显著高于TA和TG型个体(P<0.01),TA型个体的胸宽和十字部高分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)低于TG型个体。表5

表5 MYF5-exon1(236)-intron1(633)与体尺性状的关联(最小二乘均值±标准误)

2.7.3 AGPAT5-exon7(72、97)-intron3(501、515、550)

研究表明,基于连锁不平衡,AGPAT5-exon7(72、97)-intron3(501、515、550)构建了一个单倍型块,共包含6种单倍型,GTCTT为优势单倍型(0.390 6)。AGCTT型个体的体长极显著低于AAGGG、ATGGG、GGGGG、GTGGG型(P<0.01),而AAGGG型个体的体长显著高于ATGGG、GGGGG、GTCTT、GTGGG型(P<0.05)。AGCTT型个体的胸围极显著低于其他单倍型(P<0.01),GGGGG型个体显著低于GTGGG型(P< 0.05)。AGCTT单倍型个体的胸宽极显著低于AAGGG、ATGGG、GGGGG、GTCTT型(P< 0.01),而GGGGG、GTCTT型个体显著低于GTGGG型(P< 0.05)。AAGGG和ATGGG型个体的十字部高极显著低于其他单倍型(P< 0.01)。而AGCTT型个体的体重极显著低于AAGGGATGGGGGGGGGTCTT和GTGGG型(P< 0.01),GGGGGGTCTT型个体的体重极显著低于AAGGG、ATGGG和GTGGG型(P<0.01)。表6

表6 AGPAT5-exon7(72、97)-intron3(501、515、550)与体尺性状的关联(最小二乘均值±标准误)

2.8 PPARγ、MYF5和AGPAT5基因突变位点的生物信息学

2.8.1 mRNA 二级结构预测分析

研究表明,运用在线软件预测参考序列和PPARγ-exon7(G74T)、MYF5-exon1(T236C)、AGPAT5-exon7(G72A)等3个 SNP 位点的mRNA二级结构,参照未发生突变的参考序列,PPARγ-exon7(G74T)和AGPAT5-exon7(G72A)均会导致mRNA二级结构发生改变,使得RNA二级结构自由能发生变化,PPARγ外显子7的G74T突变使RNA 二级结构自由能由-56.00 kcal/mol增加到-53.30 kcal/mol,AGPAT5外显子7的G72A突变使RNA 二级结构自由能由-10.80 kcal/mol增加到-10.10 kcal/mol,均降低了mRNA二级结构的稳定性。图14

图14 PPARγ-exon7和AGPAT5-exon7 SNP位点突变前后RNA二级结构对比

2.8.2 蛋白质二级结构预测

研究表明,牛PPARγ基因外显子7和AGPAT5外显子7的2个SNP位点均为错义突变,造成了氨基酸改变,但是突变前后蛋白质二级结构相同;MYF5外显子1的SNP位点突变为同义突变,氨基酸和蛋白质二级结构均未改变。

3 讨 论

3.1 基因型频率分析

针对PPARγ、MYF5、AGPAT5这3个基因的6个突变位点进行分析发现,AA型在SNP1、2、3、6中属于优势基因,SNP4和SNP5的优势基因型为AB型,其中SNP1、SNP3的多态信息含量小于0.25,是低度多态的状态,而且SNP2、4、5、6是中度多态,新疆褐牛群体在6个突变位点选择潜力较大。群体遗传学χ2检验表明,新疆褐牛群体中PPARγMYF5和AGPAT5基因4个SNP的基因型频率处于哈代-温伯格平衡状态,2个SNP的基因频率处于哈代-温伯格不平衡状态,因为新疆褐牛在长期的选育过程中受到环境、人工选育等的影响,使群体遗传结构发生改变。动物表型并不仅仅会受到SNPs的影响[15]。在PPARγ-exon7(74)-intron2(133、170)中,属于优势单倍型MYF5-exon1(236)-intron1(633)优势单倍型而AGPAT5-exon7(72、97)-intron3(501、515、550)TCTT为优势单倍型。

3.2 PPARγ-exon7和intron2的SNP突变与体型性状关联

PPARγ一直被作为许多物种肉质和生长性状的研究候选基因[16,17]。李丽等[18]以绍兴鸭为研究材料,在PPARγ基因的8169 bp(A>C)处检测到个多态位点,其中AC型个体在8周龄时的体重显著高于CC型,53周龄时胫围显著高于AA型。对肉鸡进行研究,在PPARγ5’端调控区发现[19]4个突变位点,其中C1590272T和C1592257T分别与胸肌肌内脂肪和腹脂率显著。纪永吉[20]发现在牦牛PPARγ的第5外显子87 362 bp处存在TC突变,该SNP与牦牛生长性状显著关联。孙太红[21]对我国的6个肉牛品种研究,PPARγ的2和7上3个SNP,生长和肉质性状均有影响与研究的结果并不完全一致。研究发现,PPARγ基因7第74 bp(G/T)存在突变(SNP1),在2的133bp(G/C)和170bp(C/T)处存在突变(SNP2)。对于胸围体重,SNP1位点之中的AA型小于AB型。在SNP2中,体重AA型大于BB型。PPARγ突变位点SNP1和SNP2可作为新疆褐牛。

3.3 MYF5-exon1和intron1的SNP突变与体型性状关联性

MYF5突变影响牛、羊和猪等屠宰后的肉品质,而MYF5基因突变对牛生长性能的。Liu等[22]研究发现,猪MYF5外显子2上的突变与背最长肌pH存在显著关联,具有重要的育种价值。Zhao等[23]发现,第3内含子g.5785C>T和g.6535A>G的突变与秦川牛体长和胸围呈负相关。此外,Hua等[24]以四川大恒肉鸡为研究对象,发现MYF5外显子1约有2个SNP(87T>C和96C>T),MYF5SNP(87T>C)与活重、胴体重、半净膛重和全净膛重显著相关。姚毅等[25]MYF5与生长性状的相关性发现,试验羊MYF5基因第1外显子第328位发生AC突变,该突变与试验羊的体重管围和体长显著相关。研究发现MYF5基因236 bp(T/C)处发生突变(SNP3),MYF5基因在SNP4的位置上出现了突变在SNP3中,AA型小于AB型。

3.4 AGPA5 intron5和extron7的SNP突变与体型性状关联性

在AGPAT5的3 501 bp(G/C)、515 bp(G/T)和550 bp(G/T)处存在3个突变位点(SNP5),在其外显子7中存在2个突变位点(SNP6),SNP5位点AB型体长显著高于BB型对于胸围、胸宽体重,BB型小于其他。AB型个体体重要超过其他两种类型。SNP6位点中的BB型个体胸围低于另外两种类型。AA型个体十字部高大于BB型,AB型个体胸宽和体重要超过其他两种类型。这与卫喜民[26]在6个肉牛品种中AGPAT5-intron3的突变位点不一致,虽然突变位点不一致,但是突变位点均与不同品种牛的生长性状存在关联,可能是该基因在不同品种中存在较多的多态性。

3.5 生物信息学预测

对PPARγMYF5和AGPAT5 基因外显子突变位点进行生物信息学分析,PPARγ基因74 bp发生G/T突变,AGPAT基因 72 bp(G/A)和97 bp(A/G)发生突变,均引起了氨基酸发生改变,是错义突变。通过分析蛋白结构,蛋白结构PPARγ-exon7(G74T)和AGPAT5-exon7(G72A)均导致 mRNA 二级结构发生改变,同时自由能因此个SNP突变可能会引起其结构稳定性发生改变,也可能对相应蛋白质的结构和功能具有影响。新疆褐牛PPARγMYF5和AGPAT5基因功能。

4 结 论

基因PPARγ、MYF5和AGPAT5与牛体长、胸围、胸宽、十字步高和体重性状存在显著关联,生物信息学分析发现PPARγ基因外显子1和AGPAT5基因外显子7的2个SNP位点为错义突变,会造成氨基酸改变,并改变mRNA的二级结构。研究确定了基因PPARγ、MYF5和AGPAT5与牛体尺性状的关系。