超声法辅助提取内蒙古甘草多糖工艺及其抗氧化活性研究

◎ 董 巍，王文豹，王晓丽，付 双，野 津

（齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

甘草是我国传统的“药食同源”中草药，为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药功效[1]。由于甘草味甜，气味芳香，常常作为食品调味料出现在多种烹饪方法中。现代研究表明，多糖作为甘草的主要活性成分之一，具有多种药理学活性，表现为免疫调节、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、抑制肿瘤生长等方面[2-6]。内蒙古作为甘草的重要产区之一[7]，其具有品质优、产量大、分布广等特点，如何将内蒙古甘草多糖进行合理的开发，对其提取工艺的研究及应用价值的发挥至关重要，因而备受学者们的关注。

对于植物多糖的提取方法有很多种[8]，包括水溶剂提取法[9-10]、酶提取法[11]、微波提取法[12]、超临界流体萃取法[13]、超声辅助提取法[14]等。上述提取方法各有特点，溶剂提取法使用溶剂水作为溶媒，这种方法耗时较长、温度较高、提取效率较低。酶提取法采用复合酶，由于酶对温度要求较高，一旦温度条件发生改变，在实验过程中容易失活，导致多糖的结构被破坏。近年，超临界流体萃取法被作为提取多糖的新兴方法，原理是利用流体兼有液体和气体的特点，对很多物质有很好的溶解能力，但是其设备复杂，运行成本高。超声波辅助提取法，主要基于超声波的特点，由于其具有机械效应、空化效应和热效应，将多糖快速溶解于溶剂中，促进有效成分的溶出，反应在室温中进行，能够有效节约能源。

本研究针对甘草多糖提取工艺进行探讨，主要采用超声辅助提取方式，先对单因素进行考察筛选，再利用正交设计进行整体优化，获得最佳工艺条件，以期为其在食品、保健品等领域的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 药材

甘草采购于哈尔滨市三棵树中药材市场，经齐齐哈尔医学院董巍副教授鉴定为豆科植物甘草的干燥根和根茎。

1.1.2 试剂

无水乙醇：天津市天力化学试剂有限公司；无水葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸：成都市科隆化学品有限公司；铁氰化钾：天津市大茂化学试剂厂；三氯乙酸：天津市大茂化学试剂厂；三氯化铁：天津市大茂化学试剂厂；磷酸氢二钠：苏州诚杰精细化工有限公司；磷酸二氢钠：苏州博格瑞化工科技有限公司。

1.1.3 仪器

T6 新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用有限责任公司；FA2004B 电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；GZX-9146MBE 电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LG16-W 离心机：北京医用离心机厂；KQ-600V 型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SPARK 多功能酶标仪：TECAN/帝肯。

1.2 方法

1.2.1 甘草多糖的提取

称取适量甘草，粉碎过筛，加入适量的水进行超声提取，超声结束，经过除蛋白后，加入无水乙醇使其浓度在80%以上，4 ℃醇沉24 h。将醇沉后的溶液离心，获得甘草多糖。

1.2.2 甘草多糖的含量测定

甘草多糖的含量测定采用苯酚-硫酸法，绘制葡萄糖标准曲线，精密称取经干燥后处理的葡萄糖对照品50 mg，并定容至50 mL 容量瓶中混匀，然后从其中量取5 mL，定容至50 mL 容量瓶中，摇匀，即得0.1 mg/mL 标准溶液。精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 溶液，分别加入现配制5%苯酚溶液1 mL，并立即向其中加入浓硫酸5 mL，45 ℃水浴15 min，以490 nm 测定吸光度，以葡萄糖溶液浓度C横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，回归方程为Y=54.914X+0.001 8，相关系数R2=0.999 2。

称取甘草多糖粉末0.03 g，定容至250 mL 容量瓶中，然后从中精密量取1 mL 溶液加入10 mL 的具塞试管中，分别加入1 mL 蒸馏水、5%苯酚溶液（现配现用）1 mL 和5 mL 浓硫酸溶液，立即摇匀，45 ℃水浴15 min，在波长490 nm 处测定吸光度。按照公式（1）计算甘草多糖的提取率。

式中，C为内蒙古甘草多糖样品的浓度（g/mL），V为甘草多糖样品的体积（mL），D为稀释倍数。

1.3 单因素试验

1.3.1 料液比对甘草多糖提取率的影响

称取4 份甘草粉末，每份各10 g，分别考察4 个水平料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 ，超声温度为40 ℃，超声时间为30 min，提取次数为1 次，对甘草多糖提取率的影响。

1.3.2 超声温度对甘草多糖提取率的影响

称取4 份甘草粉末，每份各10 g，分别考察超声温度30、40、50、60 ℃ 4 个水平，超声时间30 min，提取次数为1 次，料液比为1 ∶25，对甘草多糖提取率的影响。

1.3.3 超声时间对甘草多糖提取率的影响

称取4 份甘草粉末，每份各10 g，分别考察超声时间20、30、40、50 min 4 个水平，超声温度60 ℃，提取次数为1 次，料液比为1 ∶25，对甘草多糖提取率的影响。

1.3.4 超声次数对甘草多糖提取率的影响

称取4 份甘草粉末，每份各10 g，分别考察超声次数1 次、2 次、3 次、4 次4 个水平，料液比为1 ∶25，超声温度条件设置在60 ℃，超声时间设定在30 min，对甘草多糖提取率的影响。

1.4 正交设计试验

以料液比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、超声次数（D）为筛选因素，采用四因素三水平，以甘草多糖的提取率为衡量指标，设计正交试验L9（34）对甘草多糖的超声提取工艺进行优化。正交因素水平见表1。

表1 正交因素水平表

1.5 甘草多糖的抗氧化活性研究

采用普鲁士兰法[15]。分别精密吸取各组分浓度为0.16、0.31、0.63、1.25、2.5 mg/mL 的多糖及溶液2 mL，向其加入0.2 mol/L pH 为6.8 的磷酸盐缓冲液1 mL 和1% 铁氰化钾溶液1 mL，混匀后在水浴50 ℃加热20 min，冷却，加入10% 三氯乙酸溶液1 mL，混匀后吸取1 mL 溶液于比色管中，加蒸馏水1 mL 和0.1%氯化铁溶液0.5 mL，反应10 min 后在波长700 nm 处测定吸光值。

1.6 数据处理

采用Excel 分析数据并制图，SPSS 25.0 设计正交试验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对甘草多糖提取率的影响

料液比对甘草多糖的提取率作用程度见图1，甘草多糖的提取率随着料液比的降低，多糖提取率呈现整体上升的趋势，当料液比为1 ∶25 时，甘草多糖的提取率最高。开始料液比1 ∶10 时，多糖提取率较低，随着料液比为1 ∶20，反应体系中随着溶剂的增加，甘草多糖的提取效果越来越显著，当料液比1 ∶25 时，反应体系中多糖溶出达到最大程度，多糖提取率最高。

图1 料液比对甘草多糖提取率的影响图

2.1.2 超声温度对甘草多糖提取率的影响

超声温度对甘草多糖提取率影响结果如图2所示。从图中可以看出甘草多糖提取率明显增加的趋势，当超声温度设置为30 ℃时，甘草多糖提取率为1.02%；当超声温度设置为40 ℃，多糖提取率为1.43%；当超声温度设置为60 ℃时，多糖的提取率大幅度提高，达到2.54%。超声温度的提高，促进了多糖分子的运动，极大地促进多糖的溶出速度，因而多糖的提取率较大。但是，对于超声温度也要进行严格控制，温度过高会破坏多糖结构。

图2 超声温度对甘草多糖提取率的影响图

2.1.3 超声时间对甘草多糖提取率的影响

超声时间对甘草多糖提取率影响结果如图3 所示。超声时间的不同，甘草多糖的提取率也会不同，甘草多糖整体呈现提取率先增大后减小。当超声时间设置为20 min，多糖的提取率较低；当超声时间设置为30 min，多糖的提取率达到10.02%；当超声时间设置为40 min 时，多糖的提取率下降。出现这种情况的原因是由于超声的机械效应较强，强烈的振动破坏甘草多糖的原有结构。

图3 超声时间对甘草多糖提取率的影响图

2.1.4 超声次数对甘草多糖提取率的影响

超声次数对甘草多糖提取率的影响结果如图4 所示。甘草多糖的提取率随着提取次数的增加，多糖提取率不断增加。当提取次数为3 次，多糖的提取率最大，达到10.24%；当提取次数为1 次，甘草多糖溶出较低。随着提取次数的增加，多糖溶出有增加，但是小幅度增加，当提取次数达到3 次时，多糖的提取率增加最多，但是当提取次数为4 次，多糖的提取率下降，可能由于超声的强大机械振动促使多糖的结构被破坏，提取率下降。

图4 提取次数对多糖提取率的影响图

2.2 正交试验结果

根据单因素考察的结果，确定以料液比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、超声次数（D）为试验因素，采用四因素三水平，以甘草多糖的提取率为衡量指标，确定甘草多糖的最佳提取工艺。试验结果见表2。

表2 正交设计试验结果表

从表2 中R值可知，对于甘草多糖提取率的影响程度分别是：超声次数、超声时间、超声温度、料液比，说明超声次数对甘草多糖提取率的影响最大，其次是超声时间、超声温度，料液比对甘草多糖提取率的影响最小，最佳超声提取工艺条件是A2B3C2D3，这与正交试验中提取率最高的组别不一致，因此进行验证试验。根据最佳超声提取工艺条件进行验证，按照最佳工艺条件A2B3C2D3，即料液比1 ∶20，超声温度60 ℃，超声时间30 min，超声次数3 次。进行3 次重复性试验，多糖的提取率分别为11.48%、11.67%、12.04%，三者均高于正交设计，说明通过正交设计筛选出来的工艺条件为最佳工艺条件。验证试验结果见表3。

表3 验证试验结果表

2.3 甘草多糖的抗氧化活性结果

结果如图5 所示。随着浓度的升高，甘草多糖的抗氧化能力越来越强，并与其浓度呈正相关。当浓度为2.5 mg/mL 时，抗氧化能力达到最强。

图5 不同浓度甘草多糖对铁离子还原能力测定效果图

3 结语

本试验首先探索单因素提取条件，然后结合正交设计确定超声辅助提取甘草多糖的工艺条件，即料液比1 ∶20，超声温度60 ℃，超声时间30 min，超声次数3 次，甘草多糖的提取率为11.73%。同时，初步探索了其抗氧化活性，试验证明甘草多糖具有一定的抗氧化活性。综上所述，本研究对甘草多糖提取工艺方法进行优化，并对抗氧化活性进行初步探索，以期为甘草多糖的合理利用和科学开发奠定基础。