免疫亲和柱净化-亲水液相色谱串联质谱法测定牛奶中的三聚氰胺

◎ 尹玉云，曲凌玄，王雅楠，张培毅，凡 猛， 陶 健

（1.河南省食品和盐业检验技术研究院，河南 郑州 450003；2.河南省特殊食品工程技术研究中心，河南 郑州 450003；3.国家市场监管重点实验室(食品安全快速检测与智慧监管技术)，河南 郑州 450003）

乳制品作为日常饮食的大宗消费品，其安全状况关乎每一个人的健康，2008 年曝光的中国奶制品污染事件使三聚氰胺引起社会的普遍关注和重视。三聚氰胺（C3H6N6）俗称密胺、三聚氰酰胺、蛋白精，含氮量高达66.6%，在用凯氏定氮法测定氮含量进而折算出食物总蛋白质含量时，三聚氰胺的加入可以造成高蛋白质的假象。然而，三聚氰胺作为一种化工原料，长期摄入可引起婴幼儿肾结石和肾衰竭。因此，我国不允许在食品中添加三聚氰胺。目前，乳及乳制品中的三聚氰胺已成为国家食品安全抽检及省抽检的必检项目，力图通过最严格的监管来保障人民群众“舌尖上的安全”。我国卫生部等5 部门关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告（2011 年第10 号）中明确规定，三聚氰胺在婴儿配方食品中的限量值为1 mg/kg，在其他食品中的限量值均为2.5 mg/kg。

国标GB/T 22388—2008 《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》提供了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的几种测定方法，即高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、 液相色谱-质谱/质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、气相色谱-质谱法、气相色谱-质谱/质谱法。此外，还有酶联免疫吸附法[1]、胶体金免疫层析法[2]、拉曼光谱法[3-5]、红外光谱法[6-7]、免疫亲和凝胶柱检测方法[8]等多种检测方法。GB/T 22388—2008作为国家食品安全抽检的指定检验方法，其HPLC 方法定量准确，但其定量限为2 mg/kg，如此高的定量限决定了其不适用于婴儿配方乳粉及三聚氰胺含量低的样品的检测，且HPLC 所用流动相为离子对试剂，仪器至少需要平衡5 小时方能使基线平稳，运行一个样品一般至少需要20～25 min；LC-MS/MS 法需要先提取、去蛋白、离心后过固相萃取柱、氮吹等诸多操作，然后用基质标曲外标法定量，操作烦琐、基质干扰强、回收率低；气相色谱-质谱法、气相色谱-质谱/质谱法需要硅烷化衍生，采用外标法定量，操作更加烦琐。

本文建立了一种测定牛奶中三聚氰胺的免疫亲和柱净化、内标法定量的亲水液相色谱串联质谱法，与GB/T 22388—2008 中的LC-MS/MS 方法相比，该方法具有样品用量少、前处理简单、检测速度快、无基质干扰、灵敏度高、准确度高等优点，为牛奶中三聚氰胺的快速准确检测提供了新思路、新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；乙酸铵（色谱纯）；超纯水；三聚氰胺免疫亲和柱（柱容量≥1 500 ng，实验室自制）；三聚氰胺标准物质(99.05%, DR.Ehrenstorfer)；三聚氰胺-13C3 内标标准物质溶液（100.0 μg/mL, A ChemTek Inc.）。

1.2 仪器与设备

SCIEX Triple Qand 5500+三重四级杆液质联用仪（美国，AB SCIEX 公司）；ME204E 电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]； Mili-Q 纯水仪（美国，Millipore 公司）。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 三聚氰胺标准储备液的配制

精密称取三聚氰胺标准物质50 mg（精确到0.000 1 g），用50% 甲醇水溶液（1 ∶1，V/V）溶解定容，配制成1 mg/mL 标准储备液，4 ℃冷藏保存。

1.3.2 三聚氰胺标准中间液的配制

准确移取三聚氰胺标准储备液100 μL，50%甲醇水溶液定容，配制成1 μg/mL 三聚氰胺标准中间液，4 ℃冷藏保存。

1.3.3 三聚氰胺内标中间液的配制

准确移取三聚氰胺内标标准溶液1.00 mL，用50%甲醇水溶液定容，配制成1 μg/mL 三聚氰胺内标中间液，4 ℃冷藏保存。

1.3.4 三聚氰胺工作溶液的配制

用甲醇将三聚氰胺标准中间液（浓度为1 μg/mL）逐级稀释，得到浓度分别为1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 ng/mL 的系列标准工作溶液，其中内标含量均为20 ng/mL。

1.4 试验方法

1.4.1 样品预处理

准确称取0.5 g 样品，用7 mL 0.01 mol/L pH 7.4 的PBS 溶液稀释混匀后备用。

1.4.2 免疫亲和柱净化处理

将免疫亲和柱从4 ℃冰箱取出，恢复至室温。将免疫亲和柱的上端塞子和下端堵头去掉，使柱子中的保护液自然流干，加入1.4.1 的备用样液，控制流速不超过1 滴/m。待样液滴完后，用10 mL 超纯水分两次淋洗，待淋洗液滴完后，抽干小柱，用1 mL 甲醇洗脱，供HPLC-MS/MS 测定。

1.4.3 色谱条件

色谱柱：月旭 HILIC Amide 色谱柱（2.1×100 mm，5 μm）。柱温箱温度：35 ℃；进样量5 μL；流动相：A 为5 mmol/L 乙酸铵溶液，B 为乙腈；梯度洗脱程序：0～1 min，90% B；1～2.5 min，90%～60% B；2.5～3 min，60% B；3～3.1 min，60%～90% B；3.1～6 min，90% B；流速为0.5 mL/min。

1.4.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：多反应监测（MRM），正离子扫描；电喷雾电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃ ；具体质谱条件见表1。

表1 三聚氰胺及其内标的质谱参数表

1.5 数据处理

检测结果由AB 数据处理软件自动计算。采用Origin 2023 软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

参考GB/T 22388—2008 和SN/T 5118—2019 《进出口食用动物、饲料中三聚氰胺残留测定 液相色谱-质谱/质谱法》中的离子对信息，并对离子源温度、电喷雾电压、去簇电压DP、碰撞电压CE、驻留时间等参数进行优化。根据信号响应强度，确定具体质谱参数（见表1）。

2.2 色谱条件的优化

用三聚氰胺及内标浓度均为20 ng/mL 的标准溶液考察三聚氰胺及其内标在Hilic 色谱柱和C18色谱柱上的峰形、出峰时间、信号响应（MRM 色谱图分别见图1、图2），发现三聚氰胺及其内标在C18色谱柱上不保留，出峰时间为0.91 min，出峰快、峰拖尾，信号响应远低于在Hilic 色谱柱的信号响应，峰形严重不对称，这是由于三聚氰胺属于强极性小分子物质，C18色谱柱适合分离非极性或弱极性的物质，而Hilic 色谱柱是亲水作用的色谱柱，它以极性物质为固定相，高比例极性有机溶剂和低比例水相为流动相，非常适用于强极性化合物的分离[9-10]，故本试验选择Hilic 色谱柱作为分离柱。

图1 三聚氰胺及其内标在C18 色谱柱上的多反应监测（MRM）色谱图

图2 三聚氰胺及其内标在Hilic 色谱柱上的多反应监测（MRM）色谱图

2.3 样品处理方法优化

根据Design-expert 中心组合试验设计原理，分析样品称样量、上柱体积、沉淀剂用量单因素试验结果，以三聚氰胺回收率为响应值（每份含100 ng 的三聚氰胺和20 ng 的三聚氰胺内标），采用三因素三水平的响应面分析方法分析不同因素的交互影响。根据软件设计的试验组方案进行试验后，测得三聚氰胺回收率结果如表2 所示。

表2 响应面设计方案与测定结果表

根据17 组试验结果，使用软件回归拟合分析，得出3 种因素变量和三聚氰胺回收率关系，用函数表示：Y=98.92-0.037 5A+6.33B+0.262 5C-0.125 0AB+0.250 0AC-0.125 0BC+0.715 0A2-6.36B2-0.785 0C2，回归方程R2=0.991 9，P＜0.000 1，说明回归模型为极显著。试验结果表明，本试验模型能可靠表示称样量、上柱体积、沉淀剂用量之间的交互关系。可以用该回归方程对试验结果进行分析，根据交互项方差分析结果，三因素中上柱体积P<0.000 1，表明上柱体积对三聚氰胺回收率影响作用显著，三因素之间交互作用并不明显。

根据回归方程方差分析结果，软件分析得出拟合相应曲面图，如图3～5 所示。从中可明显看出，上柱体积对三聚氰胺回收率含量有显著的影响，而样品称样量及沉淀剂用量对三聚氰胺回收率影响极小。三因素中的交互作用影响并不显著。优化后最佳上柱体积为7.5 mL。

图3 称样量-上柱体积的交互影响图

图4 称样量-沉淀剂用量的交互影响图

图5 上柱体积-沉淀剂用量的交互影响图

综上，考虑到不同样品三聚氰胺含量不同、不同的检测目的和需求，综合考虑试剂用量、成本、时间等因素，本试验样品前处理方法确定为：称取样品0.5 g，加入7 mL 0.01 mol/L pH 7.4 的PBS 溶液混匀后上柱。当样品三聚氰胺含量太高时，可选择减少称样量、减少上柱体积或者将上机液进一步稀释的方法进行测定。同时，应注意不要超过免疫亲和柱的柱容量，避免因亲和柱过载造成检测结果不准确。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准工作曲线线性范围、检出限（LOD）和定量限（LOQ）

用50%甲醇水溶液配制三聚氰胺浓度分别为1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 ng/mL 的系列标准工作溶液，其中内标含量均为20 ng/mL，按照浓度从小到大的顺序上LC-MS/MS 测定，以三聚氰胺浓度为横坐标，三聚氰胺与其内标的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线见图6。线性方程为：y=0.049 92x+0.033 12，r=0.999 89，r2=0.999 74。线性范围为1～100 ng/mL。此时，线性良好，内标信号响应稳定，色谱柱无过载情况。用空白基质加标法，以信噪比S/N≥3 确定三聚氰胺的最低检出限（LOD）为0.000 10 mg/kg，以信噪比S/N≥10 确定三聚氰胺的定量限（LOQ）为0.000 24 mg/kg，定量限（LOQ）是GB/T 22388—2008 中LC-MS/MS 法的0.024 倍，大大提高了检测灵敏度。

图6 三聚氰胺标准曲线图

2.4.2 回收率和精密度

准确称取三聚氰胺阴性纯牛奶样品0.5 g，分别加入0.5、5、50 ng 的三聚氰胺标准溶液，其中三聚氰胺内标上机浓度均为20 ng/mL，每个浓度样品进行6次平行测试。测得样品的回收率平均值和精密度（相对标准偏差relative standard deviation，RSD）见表3。结果显示，该方法的回收率为98.1%～99.2%，RSD 为1.03%～2.94%，具有较高的准确度和精密度。

表3 加标回收结果表

2.4.3 质控样及实际样品测定

用本文所述方法对2021、2022 年度本单位承担的国家食品安全抽检及河南省食品安全抽检中，从河南省18 个地市抽检的灭菌乳、巴氏杀菌乳样品各80 份进行检测，结果均未检出三聚氰胺。为进一步验证方法的准确性，分别对这160 份样品进行加标回收试验，加标浓度为50 ng，内标上机浓度为20 ng/mL，回收率在97.4%～100.6%，说明该方法有较高的准确性和可靠性。

用本文所述方法对购自大连中食国实检测技术有限公司的样品编号CFAPA-QC550A-1 牛奶中三聚氰胺质控样品进行检测，检测结果为3.09 mg/kg，质控样品指定值为3.12 mg/kg，检测结果依据“z-比分数”进行评价，∣z∣=0.12，∣z∣≤2，为满意结果，可见该方法准确度较高。

3 结论与讨论

本试验所研究的三聚氰胺免疫亲和柱净化、内标法定量的Hilic 色谱柱-HPLC-MS/MS 方法很好地消除了GB/T 22388—2008 中LC-MS/MS 方法存在的高基质干扰的弊端，并将定量限（LOQ）由GB/T 22388—2008 中的0.01 mg/kg 降到了0.000 24 mg/kg，灵敏度提高了40 余倍，大大提高了牛奶中三聚氰胺检测的准确度和灵敏度。同时，新开发的方法样品经简单稀释后即可直接过免疫亲和柱，精简了前处理过程，缩短了检测时长，减少了有机试剂用量，节省了物料和人力。

基质匹配的标曲可以在一定程度上提高检测准确度，但是不同样品基质需要配制不同的基质标曲，增加了检测工作量，不利于多细类样品的检测，且对于基质复杂的样品，用于配制基质标曲的相同基质不易获得。内标法在LC-MS/MS 中具有广泛应用，它在消除基质效应、提高检测准确度方面具有显著作用[11-12]。在能获得合适内标的情况下，内标法是提高方法准确度的最佳选择。