GC/MS代谢组学技术在食品分析中的应用进展

刘畅，李慧敏，梁丽雅，闫师杰，3*

（1.天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300392；2.天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300392；3.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300392）

代谢组学是继蛋白质组学、转录组学和基因组学后的一种新兴组学技术，是系统生物学的重要分支。它通过对生物体代谢产生的分子质量低于1 kDa 的代谢产物进行定性定量分析，以研究生物体系的代谢途径[1-3]。代谢组学方法已广泛应用于医学、合成生物学、食品科学等领域。气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC/MS） 技术经过几十年的发展已经成为一项成熟的技术，它与液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）或核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）相比，具有成本相对较低、重现性好、稳定性好和数据处理方便等优点，是代谢组学分析中最常用的技术之一[4-6]。由于各种衍生化方法的发展，气质联用可以用于分析低分子量的非挥发性化合物[7]，这一进展为GC/MS 在代谢组学领域的潜在应用带来了一个新的视角。GC/MS 通过计算样品中检测到的色谱峰保留时间指数，并与已有的数据库进行比较，如Fiehn 库、Golm 代谢组数据库、Mass Bank、Wiley 数据库和美国国家标准与技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）[8-9]，可以实现保留时间的高重复性，进而就可以对被测物进行定性和定量分析。迄今为止，已有研究者综述了代谢组学在食品中从原材料到最终产品的应用，例如食品科学与工程领域[10]、食品科学中的应用研究[11]、发酵食品研究[12]、食品安全的非靶向检测方法[13]、精准营养研究[14]以及使用非靶向质谱法鉴别食品真伪[15]等方面，但使用GC/MS 分析食品中非挥发性化合物如糖、氨基酸和有机酸等代谢组学方面的研究鲜见报道。鉴于此，在已有文献的基础上，本文综述国内外GC/MS 代谢组学技术在食品领域中的重要应用进展，以期为代谢组学在食品领域中的深入研究提供参考。

1 GC/MS 代谢组学操作流程

1.1 气相色谱-质谱样品制备及分析流程

GC/MS 代谢组学分析流程如图1 所示。

图1 GC/MS 代谢组学分析流程Fig.1 Flow chart of GC/MS metabonomics analysis

由图1 可知，样品采后需进行预处理，一般要将食物样品均质化，以有效地提取样品代谢物，减少试验误差，液体样品（如酱油、咖啡、牛奶）可以直接使用，但其他固态样品需要冷冻干燥以去除水分并磨成粉末状。在提取阶段，将萃取溶剂添加到样品中，以提取非挥发性、亲水性、低分子量化合物，包括氨基酸、糖和有机酸等，提取溶剂常用甲醇或甲醇和氯仿的混合溶液[6]。之后对提取的化合物进行衍生化，以增加极性化合物的挥发性。常用的衍生化方法主要有烷基化法、硅烷化法、酰化法、酯化法、卤化法、醚化法、环化法和离子化、成肟或腙等[7]。样品一旦衍生化，需马上将其转移至气相色谱瓶，并将小瓶放入气相色谱-质谱分析仪样品盘中进行检测分析。

1.2 基于GC/MS 的食品代谢组学数据分析

数据处理步骤主要包括数据预处理、建立单变量或多变量分析模型和模型数据评估。GC/MS 的原始数据包含各种需要反卷积和识别的峰值，不同的峰值代表小分子代谢物的强度，反卷积将实际的小分子代谢物峰值从噪声信号中分离出来[7]。然后根据与代谢物光谱库中已知光谱的相似性，对识别的峰进行注释。在数据处理后，一个包含代谢物特征和强度的数据矩阵就可用于单变量和多变量分析，目前已有分析软件有MSDIAL 程序和XCMS 在线平台[4]。除此之外，PCA和PLS-DA 是代谢组学领域最常用的统计分析方法；其中，PCA 是代谢物定量分析中常用的一种无监督降维方法，它将数据集降维到更少的维度以获得更大的方差；PLS-DA 是一种有监督的多变量数据统计分析方法，常用于筛选代谢物和分析组间整体代谢物变化[16]。

2 GC/MS 代谢组学技术在食品分析中的应用

2.1 食品鉴别与鉴定

代谢组学着重研究的是生物整体、器官或组织的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在或者外在因素的影响随时间变化的规律，是食品分析的重要工具之一。迄今为止，基于GC/MS 的非靶向代谢组学已被用于对瓜类和香料品种的分类，如莴苣、葡萄、豆豉、番茄等品种的区分和识别。Jumhawan 等[17]利用非靶向代谢组学通过对阿拉比卡和罗布斯塔咖啡分析显示，柠檬酸、苹果酸和乙醇酸是阿拉比卡咖啡的特征化合物，而肌醇、咖啡因和焦谷氨酸是罗布斯塔咖啡的特征化合物。基于这些化合物，研究者成功将鲁瓦克咖啡从其他咖啡（商业鲁瓦克咖啡、混合咖啡、商业普通咖啡和假咖啡）中分离出来。除此之外，非靶向代谢组学还用于绿茶种植环境差异鉴别[18]、红茶发酵程度[19]以及不同食材酱油调味料的鉴定[20]。

研究表明，使用天然乳清发酵剂生产的水牛马苏里拉奶酪样品中苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸含量较高，而乳清酸和尿素含量较低；使用商业发酵剂生产的非水牛马苏里拉奶酪的嗜热链球菌数量最高，半乳糖和苯丙氨酸含量较高，而直接酸化生产的马苏里拉奶酪的微生物数量较少，尿素和糖含量较高[21]。Yamada 等[22]采用气相色谱-质谱（GC/MS）联用技术对日本黑牛（和牛）和荷斯坦牛的最长肌（西冷）进行代谢组学分析，结果发现，荷斯坦西冷牛肉富含谷氨酰胺、核糖-5 -磷酸、尿酸、单磷酸肌苷、5-羟脯氨酸和甘氨酸。相比之下，和牛西冷牛肉富含麦芽糖和木糖醇。因此，和牛西冷牛肉口感丰富，带有一丝甜味。Trivedi 等[23]将非靶向代谢组学GC/MS 和脂质组学与LC/MS 相结合，从确保食品安全的角度阐述了GC/MS 技术在检测肉类污染方面的应用。该研究通过对按不同比例混合的牛肉和猪肉样品进行分析，以确定可作为检测猪肉掺假标记的小分子代谢物。综上所述，GC/MS 代谢组学技术在食品鉴别与鉴定这一领域已经得到了广泛的应用。

2.2 食品代谢物表征分析

食品材料和产品的表征传统上是针对特定的化合物进行分析和验证，这种方法较为耗时且低效[24]。目前，该方法已被代谢组学技术所替代，以描述食品原材料和产品的差异代谢物。通过代谢物对食品进行表征，已经在大米、茄子、草莓、棕榈枣、发酵食品和酱油中进行了研究。Kusano 等[25]使用一维和二维（compre hensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometer，GC×GC-TOF-MS）技术鉴定了储存在日本国家农业生物科学研究所种子库的3 000 个水稻品种中的非靶向代谢物，并揭示了天然水稻变异体代表性小分子代谢物的多样性。

Hanifah 等[5]使用GC/MS 和LC/MS 两种分析仪器，采用非靶向代谢组学技术表征了茄子的代谢物图谱，并分析其与果实形态的相关性。通过Spearman 相关分析法将注释的代谢物（GC/MS 的207 个代谢物和LC/MS 的51 个代谢物） 与14 种果实形态相关联进行分析，结果发现有几种代谢物可能对茄子的品种选育具有重要作用。Vallarino 等[26]对不同成熟期的7 个草莓品种代谢物进行了定量研究，获得了对水果属性进行分类的新认识。Das 等[27]在糖椰枣经甲醇提取及其皂化后的馏分中发现了包括有机酸、氨基酸、糖、糖醇、脂肪酸和酚在内的71 种代谢产物。其中，棉子糖、蔗糖和海藻糖等糖类会抑制淀粉酶的活性，咖啡酸、3，4-二羟基苯甲酸和奎宁酸会抑制碳水化合物的消化，阿魏酸和4-羟基肉桂酸只抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

Kwon 等[28]基于GC/MS 的非靶向代谢组学对6 种传统发酵大豆产品进行了代谢物分析。结果显示，纳豆和青果酱的氨基酸含量较高，味噌和甜面酱的糖和糖醇含量较高，青果酱中异黄酮苷和大豆皂苷含量较高。Shiga 等[29]利用GC/MS 和LC/MS 对25 种酱油进行分析研究，确定了427 种小分子化合物，并通过偏最小二乘（partial least squares，PLS）回归分析可知，对投影值影响最大的变量是N-（1-脱氧果糖-1-基） 谷氨酸（FruGLu），并发现在酱油中添加FruGLu 可提高其鲜味强度。Son 等[30]采用GC-TOF-MS 技术分析米酒中的小分子化合物，发现有18 种氨基酸含量较高，加入米曲霉会导致米酒中氨基酸含量的增加。除氨基酸外，木糖、2-甲基苯甲酸和草酸也是影响米酒品质的主要因素。Seo 等[31]基于GC/MS 代谢组学方法研究普通麦芽啤酒和窖藏啤酒之间的代谢物差异。结果表明，窖藏啤酒的代谢物谱与普通麦芽啤酒相比，普通麦芽啤酒中丙二醇、2，3-丁二醇、丙酸、甘油、琥珀酸、苹果酸、果糖、山梨醇、棕榈酸、硬脂酸和蔗糖的含量明显较高，但丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含量较低。硬脂酸和棕榈酸（r=0.98）、亮氨酸和异亮氨酸（r=0.95）、甘氨酸和丙氨酸（r=0.91）之间存在相对较高的相关性。

综上，代谢组学不仅可以用来综合评估所有的代谢物，而且还可以表征作为特定食品或原材料（如水果和蔬菜）的生物标志物。因此，代谢组学被认为是食品特性研究的一种较好的方法。

2.3 非生物性应激反应的评估

基于GC/MS 技术的代谢组学可以评估外部因素在食品生产过程中会对食品的营养价值、代谢物组成和感官属性等产生的影响。二嗪农是一种有机磷农药，从1952 年开始使用，它是提高水稻防御机制的重要化合物，该农药还会影响水稻碳水化合物和氨基酸的代谢，其主要原因是二嗪农在处理水稻过程中可以防止水稻中的甘露糖、半乳糖和棉子糖氧化损伤[32]。Wu 等[33]研究发现，二氧化钛纳米颗粒（纳米TiO2）的广泛使用会降低水稻的生物量。在水产养殖业中，饲料是实现鱼类生长最大化的重要因素之一。Baumgarner等[34]利用二维气相色谱/飞行时间质谱（GC-GC/TOFMS）对饥饿虹鳟鱼进行了代谢组学分析，发现其脂肪酸、氨基酸、三十六烷、十六烷和丙烷等外源化合物发生了显著变化，饥饿的虹鳟鱼可以增加肝脏和肌肉中脂肪酸的利用率，并促进了肝脏中的蛋白质分解代谢。

随着工业化的加速发展，重金属污染已成为环境危害的一个主要因素。铅和镉是被植物吸收并进入食物链的最常见的污染物之一。Wang 等[35]发现铅和镉改变了萝卜根整体代谢产物，特别是糖、氨基酸和有机酸。此外，将代谢组学数据与转录组学数据整合后发现，萝卜被铅危害会引起碳水化合物、能量和谷胱甘肽代谢的变化，而被镉危害会引起能量生产、氨基酸代谢和氧化磷酸化相关途径的变化。水果在冷藏过程中，由于温度的变化而产生的冷害是最常见的问题之一。Tanou 等[36]以桃子为材料，经GC-TOF-MS 分析显示，糖类化合物（木糖、麦芽糖、焦糖、山梨糖醇、麦芽糖醇）、有机酸（柠檬酸、甘油酸）和氨基酸（异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸等）主要受冷害的影响，该研究还认为异亮氨酸和缬氨酸可能是合成应激诱导蛋白的底物。

食物从种植阶段到端上餐桌要经历各种各样的过程，在这些过程中，存在多种因素对食品造成影响，不仅可能改变其成分，还可能影响其质量和安全。代谢组学能够辅助了解食品材料如何对应激源作出反应，并评估这些变化是否对食用有害。此外，对应激反应的代谢组学研究还可以确定食品中的哪些代谢物对保护自身免受应激因素（如由温度、农药和饥饿引起的应激）的影响具有重要作用。

2.4 优化食品采后加工

代谢组学是优化水果等食品采后加工的重要工具，已被广泛用于食品产品质量的改善，如芒果、山竹、火龙果和巧克力等。采后处理一般在果实收获后进行，基于GC/MS 的代谢组学通过跟踪采后过程中代谢物的变化，确定最佳果实成熟度以达到改善品质或提高货架期的目的。

Ganneru 等[37]用3 种方式（室温、乙烯和碳化钙）对新鲜芒果进行催熟处理，PLS-DA 显示，碳水化合物、糖醇、1，2，3 丙烷三羧酸、2-硫代巴比妥酸和D-葡萄糖酸-δ-内酯的水平与所使用的催熟处理有显著差异，并且糖和淀粉半乳糖、肌醇、抗坏血酸和醛酸代谢的变化也取决于不同成熟方法的处理，该试验阐明了不同的成熟处理方法对果实生理状况的影响。Clark 等[38]利用GC/MS 代谢组学技术研究了在巧克力生产加工过程中3 种不同温度和时间组合对香气的影响，结果显示，共有88 种小分子代谢物被质谱标记，主要包括吡嗪类、醛类、萜烯类、醇类、酯类和酮类等。分析发现，时间对香气的影响大于温度。受时间影响的化合物包括2-甲基丙醛、二甲基硫化物和苯甲醛等。Wu 等[39]研究表明，红光照射可延缓火龙果的腐烂速率，有助于维持火龙果的品质和保质期；采后早期的红光照射增强了糖酵解、三羧酸循环（tricarboxglic acid cycle，TCA）和醛代谢，而在晚期阶段，则诱导了与抗性有关的代谢物，如脂肪酸和挥发性化合物。因此，就优化食品采后加工而言，通过GC/MS 代谢组学技术识别差异性代谢物可以更好地了解发生在水果等食品中的生理变化，进而为加工优质的绿色食品提供科学依据。

2.5 监测食品生长和加工过程

在果实发育的过程中，基因表达的变化会导致不同组成酶的合成，进而对反映果实成熟指标的代谢物产生影响。Parijadi 等[40]基于代谢组学技术研究了山竹在成熟阶段的代谢物情况，通过使用PLS 回归模型将代谢物与山竹颜色变化联系起来，发现2-氨基异丁酸、阿洛酮糖和多种氨基酸含量随着成熟度的增加而增加，并建议将这些代谢物用作山竹成熟阶段的生物标志物。同样，基于GC/MS 的代谢组学也已被用于监测火龙果、人参浆果的果实发育以及大麦种子的生长发育[41-43]。

除了植物生长发育，基于GC/MS 的代谢组学通常还用于监测食品加工过程中代谢物的变化。在食品领域中，食品加工是指将原料食品转变为可食用产品的任何方法，诸如发酵和烘烤等技术。食品加工导致食品的化学成分发生动态变化，进而影响到代谢物。代谢组学在食品加工中的应用已在咖啡豆[44]和奶酪[45]中得到证实。

发酵是一种常见的食品加工技术，Aditiawati 等[45]利用基于GC/MS 技术的代谢组学评估了阿拉比卡咖啡豆的发酵情况，研究结果表明，风味的丰富程度在于糖类化合物，如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、半乳糖和氨基酸（如丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和丝氨酸）等特定代谢物的有无及含量的多少。Oliveira 等[46]运用顶空固相微萃取-气相色谱/质谱（headspace solid-phase microextraction gas chromatography/mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）联用技术研究了软木瓶塞和合成瓶塞对白葡萄酒挥发性成分的影响，结果表明，软木瓶塞与合成瓶塞相比，在白葡萄酒中使用软木瓶塞能够保留一些更高浓度的酯类挥发性化合物，且鉴定出的大多数化合物都与白葡萄酒的感官特性有关。因此，用软木塞密封的样品在感官上具有更好的葡萄酒香气。

因此，在监测食品生长和加工过程研究中，可以通过监测代谢物组成及含量变化的详细信息，寻找代谢物与食品生长发育或加工过程动态变化的相对关系，进而筛选出与其变化相关的生物标志物。

2.6 食品质量评估与预测

通过代谢组学对食品质量进行评估和预测是常用的方法，它是通过将代谢物图谱与食品质量特性相关联来实现。Pongsuwan 等[47]通过研究确定了绿茶的排名与绿茶代谢产物之间的相关性，结果表明，酚类化合物的含量高低是鉴别高低级别绿茶之间差异的标志物。Taniguchi 等[48]分析了15 种清酒样品与LC/MS 和GC/MS 数据之间的相关性，发现D-氨基酸图谱可以用来预测清酒感官评估中的苦味感官成分。You 等[49]评估了冷冻羊肉中的腐败生物标志物。该研究将3 个食品腐败变质指标（pH 值、总活菌数和总挥发性碱性氮）与冷鲜羊肉的代谢产物特征相关联，预测模型显示，13 种代谢物可作为冷鲜羊肉的腐败指标。

Zhen 等[50]通过对小麦籽粒的研究确定了74 种与籽粒发育不同阶段相对应的代谢物，研究发现小麦籽粒每个发育阶段的代谢标志物与该阶段的小麦面筋质量相关。Miyauchi 等[51]评估了日本绿茶人工栽培条件与专家评定记录的茶叶排名得分之间的相关性，试验通过调节绿茶栽培过程中的光照量，以收获到理想质量的绿茶。虽然人工培养能够提高绿茶氨基酸含量，但人工培养绿茶的预测排名仍低于对照样品（自然条件下生长）。赵燕妮等[52]为评价不同品种猕猴桃果实品质差异，采用气相色谱-质谱（GC/MS）联用技术对3 个不同品种猕猴桃（海沃德、哑特和徐香）果实进行分析检测，共定性出76 种化合物，主要包括糖、脂肪酸、有机酸、氨基酸等。其中，海沃德中单糖（如葡萄糖、果糖、半乳糖等）含量较高，表明海沃德甜味较佳；徐香中双糖、有机酸、TCA 循环中间体和氨基酸含量较高，表明徐香黏度较高，风味较佳；哑特中抗坏血酸含量较高，表明这个品种可以有效保持果实的新鲜香味。

尽管这些研究是基于GC/MS 和其他食品质量评价方法，但这些研究也可以应用到其他领域。未来有关代谢标志物的信息有可能被食品工业用于开发快速诊断工具，这种工具的开发将大大改变用于食品质量控制的评估标准。

2.7 食品货架期和保藏期的评估

基于GC/MS 的代谢组学也被用来评估食品的货架期和保藏期。例如，对水稻种子耐贮性评估、鱼和肉的新鲜度鉴定。除此之外，GC/MS 技术也已经在水果和蔬菜中得到了广泛应用。

对于植物产品如水稻，种子储藏是作物育种的一个重要方面。然而，到目前为止涉及到种子可储藏性的机制仍不清晰。Yan 等[53]评价了贮藏时间（贮藏期短和贮藏期长）对两个不同表现型杂交水稻品种的影响。在贮藏24 个月期间，贮藏期短的品种中有19 个代谢产物发生了显著变化，而贮藏期长的品种中只有8 个代谢产物发生了显著变化；在贮藏过程中，糖类物质可能在调节种子活力和耐干燥性方面发挥重要作用，氨基酸在储藏期短的品种中的积累高于储藏期长的品种。Mabuchi 等[54]基于GC/MS 代谢组学方法，研究证明有机酸、糖类和维生素是评估鱼肉新鲜的很重要标志物，这些代谢物在普通肌肉和深色肌肉之间的表现不同。此外，通过对鱼肉新鲜度的代谢组学研究，结合正交偏最小二乘法（orthogonal partial least square，OPLS）回归多变量分析，实现了对深色肌肉的评价，而传统方法难以做到的。金文刚等[55]采用气相色谱-质谱联用非靶向代谢组学结合多元统计模型探究大鲵肉在4 ℃不同冷藏时间（0、2、4、8 d）肌肉代谢物的差异。结果表明，不同冷藏时间大鲵肉中共筛选出69 种差异代谢物，包括有机酸类及其衍生物（21 种）、氨基酸类及其衍生物（14 种）、糖类及其衍生物（7 种）、核苷酸类及其衍生物（10 种）、胺类及其衍生物（6 种）和其他类化合物（11 种）。代谢通路映射及Pearson 相关性分析表明，L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、丙酮酸、丁二酸和甘氨酸可作为大鲵肉品质变化的潜在标记物。

气调是延长水果和蔬菜货架期常用的方法之一。气调条件主要是降低氧和提高二氧化碳水平，从而降低呼吸速率，推迟成熟过程，最终改善水果和蔬菜的质量和感官特性。基于GC/MS 的代谢组学技术在气调条件下测定了草莓的糖（葡萄糖、核糖和肌醇）和有机酸（苹果酸、草酸、乙酸和磷酸）含量，进而解释了较高的糖度可能调控了草莓成熟和衰老的延迟[56]。帝皇乌蓝是一种常用的食品和传统草药，在室温下，代谢产物在0、2、4 h 和12 h 随贮藏时间变化而变化，在早期发现肌醇、苯甲酸和其他次生代谢物如儿茶素和α-生育酚可以区分贮藏的样品和新鲜样品，贮藏12 h 后，发现蔗糖、吡喃半乳糖和松二糖等糖与新鲜样品中的糖不同[57]。

上述研究结果表明，在研究食品的货架期和保藏期方面，代谢组学不仅可以识别食品变质过程中起关键作用的代谢物，而且还可以通过代谢物上调或下调这些数据来解决与食品货架期短相关的问题。

3 结语

在食品分析中，GC/MS 是代谢组学领域的一个重要方法，此技术不仅能够评估非挥发性、低分子量的亲水化合物，而且还可以提供反映食品样品表型差异或质量的重要信息。基于GC/MS 的代谢组学已经被广泛应用于区分和鉴定食品样品、描述食品样品代谢物的特征、评估外部环境因素对食品生产链中的影响、优化水果和蔬菜的采后过程、监测植物生长或食品加工过程、评估和预测食品的质量、食品贮藏条件和货架期。但是，基于GC/MS 的代谢组学方法并不完美，亟需扩大可标注高置信度代谢物的覆盖范围，制定样品衍生化的标准操作程序。因此，未来创建一个全国共享的具有数据库作用的在线统一平台，进而将单独的代谢物数据库组合起来，形成一个全面的、丰富的GC/MS代谢组数据资源和知识库。研究人员可以利用这些信息研发用于食品评估的快速诊断工具，工程师可以开发提高生产线食品质量的工艺。