不同基因型箭筈豌豆裂荚特性研究

杨 丰, 张明均, 陈 超, 郝云飞, 陆忠杰, 董 瑞

(1.贵州省草地技术试验推广站, 贵阳 550025; 2.贵州省畜禽遗传资源管理站, 贵阳 550001;3.贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025)

裂荚是指荚果在成熟期时,沿着荚皮背缝线和腹缝线开裂使种子撒播的现象[1-4]。裂荚特性广泛存在于豆科(Leguminosae)、禾本科(Poaceae)和十字花科(Brassicaceae)等植物中[5-7],这是植物在长期进化、演变过程中形成的重要生理特性。裂荚对植物的繁衍生息、种子的传播以及保持物种的多样性具有十分重要的意义[8],但对种子的收获和生产却造成了严重的障碍和损失[9]。吴建禹等[10]研究发现,扁蓿豆(Melissilusruthenicus)单株在自然条件下的平均裂荚率为76.50%。胡立成[11]研究了大豆品种北娘和丰铃,发现其裂荚率分别为95%和81%。孙东凤和康玉凡[2]研究表明,中度裂荚的大豆品种产量减少约112.5 kg/hm2。由高裂荚率造成的“种子收获难、买不到、用不起”的现象十分严重[12]。因此,对裂荚果的研究具有重大意义。

箭筈豌豆(Viciasativa)是一年生、自花授粉豆科植物[13],具有生育周期短、适应性强等特点、固氮及改善土壤结构的能力,主要用作饲草和绿肥[14]。现有的箭筈豌豆品种大部分都具有裂荚的生理特性,造成种子在收获期前大量脱落,并在下一个生长季作为杂草出现,对种子生产及下一季作物的种植造成了严重影响,成为限制箭筈豌豆进一步大面积推广使用的重要因素[15-16]。目前豆科植物裂荚的生理机制主要有两种[17],一是裂荚与荚果内部的组织结构存在密切联系,在自然或外部机械压力下,造成了荚果背或腹缝线上的某一位点开裂,且腹缝线是荚果开裂的首要部位[18];二是酶调控裂荚,即通过细胞壁修饰酶对荚果离区细胞进行降解,如多聚半乳糖醛酸酶,纤维素酶等,导致离区细胞分离,产生裂荚。以上两种机制相互联系,共同作用导致荚果开裂。

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PGs)是一种细胞壁结构蛋白[19],通过水解反应切断果胶分子主链糖苷键的解聚酶[20],也称为果胶酶(Pectic enzyme)、果胶解聚酶(Pectin depolymerase)[21]。在目前已明确的10个多聚半乳糖醛酸酶的晶体结构中,有8个是内切多聚半乳糖醛酸酶,只有2个属于外切多聚半乳糖醛酸酶[22]。内切多聚半乳糖醛酸酶可随机水解豆科植物荚果离区组织内果胶分子中的α-1,4-糖苷键,促进胞间层分解及细胞壁破裂,是调控裂荚的必要因子[21]。

本研究在前期工作的基础上,筛选出了5份抗裂荚种质和5份易裂荚种质作为材料,对箭筈豌豆荚果含水量、荚果裂荚机械力和内切多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因(VSPG1)表达量与荚果裂荚率的关系进行探讨,以期了解其裂荚特性,为抗裂荚与高种子产量品种选育提供材料和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验所用的箭筈豌豆材料是通过前期实验从75份种质中筛选出来的5份抗裂荚种质和5份易裂荚种质,种质详细信息见表1。

表1 10份箭筈豌豆种质信息

1.2 试验地概况

试验地点位于贵州省贵阳市花溪区贵州大学实验田(106°07′E,26°11′N,海拔1 100 m),地处贵州高原中部。该区具有明显的高原气候特点,属于亚热带湿润温和型气候。年平均气温14.8 ℃,年均降雨量1 347.3 mm。试验期间贵阳市花溪区月平均降水量与月平均气温见图1。

图1 2020年10月—2021年5月试验地气象变化

1.3 试验设计

试验共进行8个月,从2020年10月到2021年5月,每个种质设3个重复。每个重复种植10个单株且种植在同一个花盆内。施肥灌水等条件相同,荚果在黄熟期进行取样。取贵州大学西校区试验点黄壤土过筛(2 mm)后作为种植土壤,每盆装土约5 kg。土壤pH值为5.84,全氮655 mg/kg、全钾26.13 g/kg、全磷0.76 g/kg、速效钾293.33 mg/kg、有效磷4.74 mg/kg、有机碳5.68 g/kg。

1.4 荚果含水量测定

将采集到的荚果称取30 g放入铝盒中,3个重复。先置于干燥器中自然风干7 d,之后将盛有样品的铝盒置于35 ℃ 热风干燥烘箱持续烘干6 h后称重,计算荚果含水量[11,23]。

1.5 荚果裂荚率测定

荚果干燥方式与测定荚果含水量的干燥方法相同,将干燥后的荚果置于2 m高处,使荚果自由掉落。清点摔裂的箭筈豌豆荚果数。摔裂的荚果数除以测量的荚果总数乘以百分之百为种质裂荚率,每份种质每个重复测量50个荚果,3次重复。详细方法请见董瑞等[24]专利。

1.6 荚果裂荚机械力测定

利用艾德堡HP-50数显推拉力计(乐清市艾德堡仪器有限公司)测定荚果开裂时所受机械力大小。测定荚果垂直裂荚机械力时,用夹子夹住荚果中部将荚果垂直固定于推拉力计,后缓慢转动数显推拉力计直至荚果开裂,当荚果开裂时推拉力计可瞬时自动记录受力的最大值。测定荚果水平裂荚机械力时将荚果水平固定于推拉力测定仪,其余操作步骤相同。每份种质每个重复测量50个荚果,3次重复。

1.7 PG酶含量动态变化分析

利用多聚半乳糖醛酸酶检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,BC2665)对各种质开花后10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的荚果离区组织中的PG酶含量进行检测。

1.8 VSPG1基因表达模式分析

采集开花后10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的荚果离区组织,采用Trizol法提取总RNA 并反转录成cDNA备用。利用课题组前期对箭筈豌豆转录组测序数据中筛选出与裂荚相关的VSPG1基因,并将在箭筈豌豆转录组表达谱中表现相对稳定且功能尚未明确的Unigene68614作为内参基因[13]。使用Primer Premier6软件设计基因的特异引物,引物信息见表2。qRT-PCR反应程序为:95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,45个循环。内参基因与目标基因在每个样品中进行3次qRT-PCR,最后使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达水平。

表2 qRT-PCR分析的引物信息

1.9 数据分析

通过SPSS23.0统计软件对各种质之间的机械裂荚力以及单个种质不同时间点荚果离区组织中的PG酶含量进行方差分析,对各种质的裂荚机械力和裂荚率进行相关性分析,并使用Excel2019软件对数据进行统计和作图。

2 结果与分析

2.1 荚果含水量

通过烘干法对10份箭筈豌豆种质的荚果含水量进行研究发现,不同种质之间的荚果含水量差异不显著,其中,L461的荚果含水量最高,为5.170%,L29的荚果含水量最低,为4.944%(表3)。10份种质的平均荚果含水量为5.116%。同时,对不同类型箭筈豌豆的荚果裂荚率进行方差分析,发现10份种质之间的荚果裂荚率存在极显著差异,其中L92和L29的荚果裂荚率最高,为100%,B17和B62的荚果裂荚率最低,为0(表3)。

表3 10种箭筈豌豆种质荚果含水量和荚果裂荚率

2.2 荚果裂荚机械力

荚果在水平放置状态下荚果裂荚机械力测试方法如图2A～图2D所示。在抗裂荚种质中,B62这一种质的荚果裂荚机械力最大,为11.298 N,B302种质的荚果裂荚机械力最小,为7.046 N(表4)。在易裂荚种质中,L461这一种质的荚果裂荚机械力最大,为2.545 N,L92种质的荚果裂荚机械力最小,为1.708 N。值得注意的是,在水平放置状态下荚果裂荚机械力最小的抗裂荚种质(B302)与荚果裂荚机械力最大的易裂荚种质之间(L461)裂荚机械力仍然存在极显著差异。荚果在垂直放置状态下荚果裂荚机械力测试方法如图2E、F所示。在抗裂荚种质中,B302的荚果裂荚机械力最大,为26.137 N,B62的荚果裂荚机械力最小,为21.282 N。在易裂荚种质中,L461的荚果裂荚机械力最大,为8.888 N,L92种质的荚果裂荚机械力最小,为5.201 N。另外,在垂直放置状态下荚果裂荚机械力最小的抗裂荚种质(B62)与荚果裂荚机械力最大的易裂荚种质(L461)之间裂荚机械力也存在极显著差异。

注:A和B为垂直裂荚机械力测量时荚果放置方式;C和D为垂直放置时荚果受力开裂直到完全裂开;E为水平裂荚机械力测量时荚果放置方式;F和G为水平放置时荚果受力开裂直到完全裂开;H为推拉力计操作界面;图中荚果开裂位置均为腹缝线部位。

表4 箭筈豌豆种质荚果水平和垂直状态下裂荚机械力

由图3也可以看出,无论是易裂荚还是抗裂荚种质,垂直放置时荚果裂荚机械力都显著大于水平放置状态时的荚果裂荚机械力,且随着荚果裂荚率的逐渐升高,荚果裂荚机械力则呈逐渐降低的趋势。

注;柱形上方的不同小写字母表示存在显著差异(p<0.05)。下同。

2.3 荚果裂荚率和荚果裂荚机械力的相关分析

进一步研究发现,箭筈豌豆的荚果水平裂荚机械力和垂直裂荚机械力都与箭筈豌豆的荚果裂荚率呈极显著负相关。其中,垂直裂荚机械力与裂荚率之间的相关性系数为-0.986,水平裂荚机械力与裂荚率之间的相关性系数为-0.960(表5)。

表5 箭筈豌豆裂荚机械力与裂荚率之间的相关性分析

2.4 PG含量动态变化分析

在5种易裂荚种质中,荚果离区组织中的PG酶含量随着荚果成熟天数的增加而显著上升,且都在22 d左右时PG酶含量达到最大,在26 d左右时略微下降,但下降差异均不显著(图4)。在5种抗裂荚种质中,荚果离区组织中的PG酶含量同样随着荚果成熟天数的增加而显著上升,且除了B17在26 d左右时PG酶含量达到最大外,其余种质均在22 d左右时PG酶含量达到最大,之后在26 d左右时略微下降,但除了B302下降差异显著外,其余种质下降差异均不显著(图5)。虽然大部分抗裂荚种质和易裂荚种质荚果离区组织中的PG酶含量均是在22 d左右时达到最大,但5种抗裂荚种质荚果离区组织中最大水平时的PG酶含量显著小于5种易裂荚种质最大水平时的PG酶含量(图6),且仅相当于5种易裂荚种质荚果发育10～14 d时离区组织中的PG酶含量(图4,图5)。

图4 5种易裂荚箭筈豌豆种质荚果发育过程中PG酶含量动态变化

图5 5种抗裂荚箭筈豌豆种质荚果发育过程中PG酶含量动态变化

图6 10份箭筈豌豆种质荚果发育第22天时PG酶含量对比

2.5 VSPG1基因表达模式分析

利用qRT-PCR技术分别检测箭筈豌豆种质荚果发育10 d,14 d,18 d,22 d,26 d的调控多聚半乳糖醛酸酶表达的VSPG1基因表达量。如图7所示,10种种质荚果离区组织中VSPG1基因表达量均在22 d左右时达到最大,在26 d左右时略微下降。这与箭筈豌豆荚果发育过程中离区组织中PG酶含量的变化趋势一致。

图7 10份箭筈豌豆种质荚果发育过程中VSPG1基因表达量动态变化

3 讨 论

胡立成[11]研究发现,大豆的荚果含水量与裂荚率呈显著负相关,荚果的含水量越低裂荚率越高,且当荚果的含水量小于5.00%时,荚果的裂荚率达到最大。杨德旭等[25]对国内的大豆品种进行研究发现,只有当大豆的含水量低于25.00%且豆壳的含水量在15.00%以下时,大豆才能发生裂荚。在其他科植物中,荚果的含水量对裂荚也有一定的影响,如在花生品种中花生荚果含水量为12.0%～13.5%范围时,脱壳率最高[26]。综上所述,在准确评估箭筈豌豆以及其他相关植物的裂荚特性之前,应先去除荚果含水量对其产生的影响。在本试验中,对10种所试箭筈豌豆荚果材料进行自然风干和烘箱烘干共同处理,荚果的含水量都降至5.12%左右,且各种质之间的荚果含水量差异不显著(表3),表明此时的荚果含水量已趋于稳定,可以忽略其对裂荚率以及裂荚机械力的测量所产生的影响。

荚果的裂荚机械力也常作为相关物种品种改良的目的指标之一。Davies等[27]对6个品种的油菜角果进行裂荚测试,测得A品种与E品种角果的最大机械裂荚力分别为0.58 N和5.90 N,差异极显著。因此,认为通过育种的手段来改良油菜的裂荚特性是可行的。本实验中,利用数显推拉力计对10种箭筈豌豆的垂直和水平方向的裂荚机械力进行了测量。其中,当荚果垂直放置时,易裂荚种质和抗裂荚种质的平均裂荚机械力为6.79 N和24.04 N,差异显著(表4)。当荚果水平放置时,易裂荚种质和抗裂荚种质的平均裂荚机械力为2.23 N和9.16 N,差异显著(表4)。且通过相关性分析发现,箭筈豌豆的荚果裂荚率与垂直裂荚机械力和水平裂荚机械力都呈极显著负相关(表5)。本研究认为,通过箭筈豌豆荚果的水平裂荚机械力以及垂直裂荚机械力的大小,可以准确地反映出箭筈豌豆裂荚率的变化。因此,可以将箭筈豌豆裂荚机械力的大小作为评价其裂荚特性的方法之一,这也与Davies等[27]的研究结果相符。本研究表明,测量箭筈豌豆荚果的裂荚机械力时,荚果的裂荚机械力大于抗裂荚种质平均裂荚机械力的种质应定义为不易裂荚种质。相反,裂荚机械力小于易裂荚种质平均裂荚机械力的种质则定义为易裂荚种质。

Agrawal等[28]对大豆荚果中的纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性进行了检测,发现多聚半乳糖醛酸酶主要存于荚果离区中间层。Sander等[29]在十字花科植物油菜(Brassicanapus)中鉴定到了一个PG基因(RDPG1),其启动子活性分析结果表明,该基因主要在荚果和花药的离区表达。Dong等[30]对大豆荚果的微观结构进行对比发现,抗裂荚种质荚果离区组织中的纤维帽细胞数量以及细胞壁厚度远大于易裂荚种质,因此认为荚果开裂与纤维帽细胞的发育有密切联系。以上研究结果均表明,荚果的裂荚特性受荚果的离区组织结构影响。由于荚果的水平裂荚机械力测量时的受力部位为荚果离区组织附近,而垂直裂荚机械力测量时的受力部位则为荚果表皮。因此,本研究认为荚果的水平裂荚机械力比垂直裂荚机械力更为科学、精确。且抗裂荚种质的平均水平裂荚机械力是易裂荚种质的4.1倍,而平均垂直裂荚机械力是易裂荚种质的3.5倍(表4),可见用水平裂荚机械力来评定裂荚等级更为准确。

本研究对10份箭筈豌豆种质荚果成熟过程中离区组织中的PG酶含量的动态变化进行检测发现,大部分种质腹缝线离区组织中的PG酶含量在22 d左右时达到最大,之后略微下降(图4,图5)。原因可能是荚果逐渐接近完全成熟状态时,水分和干物质含量急剧下降导致部分PG酶发生降解。5种抗裂荚种质腹缝线离区组织中最大水平时的PG酶含量仅为5种抗裂荚种质最大水平时PG酶含量的三分之一,差异显著(图6)。因此,荚果接近成熟状态时,腹缝线离区组织中的PG酶含量是决定其是否裂荚的重要因素,这也与Agrawal等[27]的研究结果一致。VSPG1通过在荚果离区细胞胞间层不断积累致使其逐渐溶解,并最终导致胞间层的消失,其对细胞壁的修饰十分明显[31]。除此之外,VSPG1还有葡萄糖酶协同作用来削弱荚果离区细胞的初生壁[31]。本研究中,10种种质的VSPG1基因的表达模式基本相同(图7),且分别与各自种质荚果离区组织中的PG酶含量动态变化一致。因此,本研究认为VSPG1基因通过调控荚果离区组织中的PG酶表达从而导致裂荚。这为从基因水平出发改良和选育抗裂荚和高种子产量品种提供了新的思路。