响应面法优化白英粗多糖提取工艺及其体外抗氧化活性的分析

黄明浩，黄泰奇,2，邓丽娟,

（1.武汉东湖学院生命科学与化学学院，湖北武汉 430212；2.武汉科技大学医学院，湖北武汉 430065）

白英（SolanumlyratumThunb.）为茄科草质藤本，又名山甜菜、白毛藤、排风草。白英以全草及根入药，具有祛风利湿、清热解毒、抗肿瘤等功效[1]，是临床上常用抗癌中草药[2-4]，可用于制作保健食品[5]。白英多糖是白英的主要活性成分，具有抑菌[6]、抗癌[7-8]、增强免疫力[9]等药理活性。目前，白英多糖的提取工艺多采用传统方法，王林江等[10]通过石油醚回流脱脂、乙醇回流除去单糖和低聚糖，采用沸水浸提法提取白英多糖。杨惠麟等[11]通过乙醇超声波提取去除单糖等小分子物质，采用加热回流法提取白英多糖。Wu 等[12]采用沸水抽提同时进行机械搅拌的方法提取白英多糖。上述方法皆采用沸水提取白英多糖，不仅提取时间长，而且高温易造成多糖降解及失活[13]，从而使提取率降低。超声波辅助提取是通过超声波的机械效应及空化效应，使植物细胞壁破碎，有利于有效成分的溶出，目前已被广泛运用于天然活性物质的提取。Chen 等[14]采用不同方法提取山楂多糖发现沸水抽提山楂多糖平均得率为5.88%±0.19%，超声波提取山楂多糖平均得率为7.47%±0.05%。结果表明，就山楂多糖的提取而言，超声波法与沸水抽提法相比，具有提取速度快，提取率高，提取温度低等明显优势。目前暂无超声波法辅助提取白英多糖的报道。另外，有研究发现白英的醇提物具有一定的抗氧化作用[15]，但白英的水提物的抗氧化活性未见报道。毛建山等[16]对白英多糖进行红外光谱检测，发现其具有可供氢官能团，这表明白英多糖具有潜在的抗氧化作用。因此，本研究采用超声波法提取白英多糖，通过响应面设计对白英多糖的提取工艺进行优化，并测定其抗氧化活性，旨为白英多糖的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白英干品 购于安徽省亳州市亳源通中药材种植有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）合肥巴斯夫生物科技有限公司；抗坏血酸（VC）天津登峰化学试剂厂；无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸、乙醇等试剂均为分析纯。

KQ-100DE 超声波清洗机 昆山市超声波仪器有限公司；ZT-2L 旋转蒸发仪 郑州紫拓仪器设备有限公司；7200 可见光分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；SHZ-D 循环水真空泵 郑州杜甫仪器厂；NanoDrop 2000 超微量分光光度计 赛默飞世尔科技公司；Nicolet iS5 傅里叶红外光谱仪 赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白英多糖的提取方法

1.2.1.1 白英粉末的前处理 将白英干品用小型粉碎机粉碎，过60 目筛后按1:10 比例加入95%乙醇超声提取1 h，去除其中的还原糖和杂质，过滤后烘干保存备用。

1.2.1.2 白英多糖的提取 称取白英全草粉末25.0 g，在预设超声条件下进行提取过滤后得提取液，减压浓缩至10 mL，将浓缩液通过活性炭脱色，收集脱色液。加入等体积6%三氯乙酸与脱色液混合，冷藏过夜后过滤，用10% NaOH 调pH 至中性，减压浓缩，向浓缩液中加入3 倍体积的95%乙醇4 ℃静置2 h，5000 r/min 离心5 min，取其沉淀，依次用丙酮、乙醚反复洗涤，60 ℃烘干至恒重得白英多糖[11]。

1.2.2 多糖得率的测定 参考张鹏等[17]报道的方法：配置0.1 mg/mL 标准葡萄糖溶液，精密吸取标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 分别置于试管中，加蒸馏水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，置沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温，于490 nm 处测定吸光值。以浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线，得出线性回归方程：y=11.848x+0.0244，R²=0.9993。取0.5 g 白英粉末，在预设超声条件下进行提取，抽滤，滤液转移至100 mL 容量瓶内定容，得供试品溶液。准确吸取供试品溶液0.2 mL，依照上述方法测定白英多糖浓度，并依据公式计算白英多糖得率：

式中：C 表示白英多糖浓度，g/mL；V 表示供试品溶液体积，mL；D 表示稀释倍数；W 表示白英粉末质量，g。

1.2.3 单因素实验 固定超声功率120 W，超声波频率40 kHz，料液比1:30 g/mL，提取时间30 min，提取温度20 ℃，分别探究料液比（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100 g/mL），提取时间（20、30、40、50、60、80、100 min），提取温度（40、50、60、70、80 ℃）对白英多糖得率的影响。

1.2.4 响应面试验设计 根据单因素试验结果，以料液比（A）、提取时间（B）和提取温度（C）为变量，以白英多糖得率为响应值，设计三因素三水平试验，因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.5 白英多糖的紫外光谱分析 精确配制浓度为1 mg/mL 白英多糖水溶液，以纯水作空白，进行全波长扫描（200～800 nm）。

1.2.6 白英多糖的红外光谱分析 称取2 mg 白英多糖，加入适量的光谱纯KBr 粉末研磨混匀压片，红外光谱仪扫描范围为400～4000 cm-1，初步分析白英多糖的官能团及结构。

1.2.7 白英多糖的抗氧化活性分析

1.2.7.1 白英多糖对DPPH 自由基清除能力的测定 配制不同浓度的白英多糖溶液，各取2 mL 与DPPH 溶液（2 mL，0.2 mmol/L）混合，在室温下避光反应30 min。以无水乙醇为空白，Vc 为阳性对照，在517 nm 下测定吸光值[18]，重复3 次，按下式计算DPPH 自由基清除率：

式中：As为白英多糖溶液与DPPH 溶液混合后的吸光值；Ab为白英多糖溶液与无水乙醇混合后的吸光值；A0为纯水与DPPH 溶液混合后的吸光值。

1.2.7.2 白英多糖对ABTS 自由基清除能力的测定 配制7.4 mmol/L ABTS 二铵盐储备液和2.6 mmol/L K2S2O8储备液，将上述两种储备液各取1 mL 混合，避光环境下室温放置12 h，用磷酸盐缓冲液（pH7.4）将上述混合液稀释至吸光度为0.70±0.02，此溶液即为ABTS+自由基工作液。配制不同浓度的白英多糖溶液，各取0.4 mL 与4 mL ABTS 自由基工作液在室温下避光反应6 min，在734 nm 处测定吸光值，重复3 次。以Vc 为对照组，利用如下公式计算ABTS+自由基清除率[19-20]：

式中：A0为纯水与ABTS 工作液混合后的吸光值；A1为白英多糖溶液与ABTS 工作液混合后的吸光值。

1.3 数据处理

采用Origin Pro 2022 软件作图，通过Design Expert 13 软件对响应面数据进行模型构建和方差分析，使用SPSS Statistics 23 软件进行数据差异性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 料液比对白英多糖得率的影响 不同料液比对白英多糖得率的影响见图1。随着料液比的增大，白英多糖得率呈上升趋势，在1:60 g/mL 时达到最大（6.50%±0.09%），之后白英多糖得率显著下降，可能是因为过多的水会使体系的单位空化能量降低，从而不利于白英多糖的溶出，导致多糖得率降低[21-22]。因此，响应面优化试验的料液比选择1:40、1:60、1:80 g/mL。

图1 料液比对白英多糖得率的影响Fig.1 Effect of liquid to material ratio on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.1.2 提取时间对白英多糖得率的影响 不同提取时间对白英多糖得率的影响见图2。在40 min 时白英多糖得率达到最大（7.05%±0.10%），随着提取时间的延长，白英多糖得率缓慢下降，可能是因为多糖在超声时间过长后会被诱导降解，导致多糖得率下降[23]。因此，响应面试验的提取时间选择20、40、60 min。

图2 提取时间对白英多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.1.3 提取温度对白英多糖得率的影响 不同提取温度对白英多糖得率的影响见图3。随着提取温度升高，白英多糖的得率先上升后下降，提取温度为70 ℃时，白英多糖得率最高（7.31%±0.16%），这说明提取温度的升高会增加溶液体系内的分子热运动，有利于白英多糖的溶出；但提取温度过高，可能会使多糖糖苷键断裂，造成多糖水解从而导致得率降低[24]。因此，响应面试验的提取温度选择60、70、80 ℃。

图3 提取温度对白英多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面试验设计与结果 响应面试验设计及结果见表2。采用Design-Expert 软件对实验数据进行二次多项拟合回归，所得模型：Y=7.13-0.1413A+0.24B-0.8688C-0.29AB-0.2425AC-0.31BC-0.2028A2-0.2602B2-1.18C2。从表3 可以看出，该回归模型的P<0.0001，具有极显著差异，说明该模型具有较好的稳定性[25]，失拟项P=0.8476>0.05，不显著，说明未知因素对实验结果干扰较小。模型决定系数（R2）=0.9801，调整决定系数（R2Adj）=0.9545，表明此模型拟合程度良好[26]。通过F值检验可以看出，温度对白英多糖得率影响最大，其次为时间，最后是料液比。

表3 回归模型的显著性检验及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of regression models

2.2.2 各因素响应面分析 采用Design-Expert 程序对响应面试验的结果作曲面图，同时分析各因素之间的交互作用。响应面图中曲面越弯曲表明研究因素对结果影响越大[27]，等高线的形状呈椭圆形表明研究因素之间的交互作用影响显著，呈圆形则说明交互作用影响不显著[28]。由图4 可知，温度与料液比和温度与时间的响应面曲面的弯曲程度较大且均向温度弯曲，其等高线图为椭圆形，说明这两种交互作用对白英多糖得率的影响显著，温度对于白英多糖提取的影响最为显著，与方差分析F值检验所得结果一致。

图4 各因素交互作用对白英多糖得率影响的响应面图Fig.4 Response surface graphs of the interaction of various factors on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.2.3 最优提取工艺验证 Design-Expert 软件给出的最优白英多糖提取条件为提取温度65.18 ℃、提取时间57.95 min、料液比1:57.15 g/mL，预测的得率为7.448%。根据实际操作可行性，调整提取温度65 ℃、提取时间58 min、料液比为1:57 g/mL，在此条件下白英多糖实测得率为7.54%±0.12%，与预测值差异较小。该结果与王林江等[10]、杨惠麟[11]、Wu等[12]用沸水抽提的结果（1.84%、0.96%、2.37%）相比有较大提升。与Wu 等[12]的提取时间（5 h）相比有较大的优化。说明与沸水抽提法相比较，超声波辅助提取可有效提高白英多糖的得率，同时缩短提取时间。

2.3 白英粗多糖的紫外和傅里叶变换光谱分析

白英多糖紫外光谱图见图5。白英多糖样品在237 nm 处有最大吸收峰，说明样品中可能含有不饱和羰基、羧基等[29]。在260 和280 nm 处没有明显的吸收峰，说明白英多糖提取物中的核酸和蛋白质已去除。

图5 白英多糖紫外光谱图Fig.5 Ultraviolet spectrogram of Solanum lyratum polysaccharide

白英多糖的红外光谱结果见图6。3430.94 cm-1附近的宽而强的吸收峰是由O-H 键的伸缩振动引起，此为多糖的特征吸收峰[30]。2926.14 cm-1处的吸收峰是由糖环上C-H 键的对称伸缩振动引起[31]，1623.91 和1434.29 cm-1处的吸收峰为羧基和羰基引起，表明白英多糖中存在糖醛酸结构[32]，1151.29 cm-1处的峰为糖苷键C-O-C 的伸缩振动引起[33]。400～900 cm-1处有强吸收峰，表明存在吡喃糖环结构[34]。综上，红外光谱表明样品具有糖类化合物的特征峰，可以判断为糖类化合物。这与毛建山等[16]研究结果相似。

图6 白英多糖红外光谱图Fig.6 Infrared spectrogram of Solanum lyratum polysaccharides

2.4 白英粗多糖的体外抗氧化活性分析

图7 为白英多糖体外抗氧化活性结果。白英多糖在浓度0.2～5.0 mg/mL 和0.1～6.0 mg/mL 时分别具有较强的DPPH 和ABTS+自由基清除活性，均呈现出明显的剂量效应关系。白英多糖浓度越高，其抗氧化能力越强；在浓度为5.0 mg/mL 时其对DPPH自由基的清除率最大，达到98.35%±0.54%；在浓度为6.0 mg/mL 时其对ABTS+自由基的清除率最大，为96.57%±0.79%。白英多糖对DPPH 和ABTS+自由基的半抑制浓度（IC50）分别为1.104、1.408 mg/mL，表明白英多糖具有良好的体外抗氧化活性。

图7 白英多糖体外抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of Solanum lyratum polysaccharides in vitro

3 结论

本研究采用超声波法辅助提取白英粗多糖，用苯酚-硫酸法测定白英粗多糖含量。在单因素实验的基础上，利用Box-Behnken 响应面法优化试验设计，得到最佳的白英粗多糖提取工艺为：料液比1:57 g/mL、提取时间58 min、提取温度65 ℃。最后所得白英粗多糖得率为7.54%±0.12%，与预测值差距较小，说明该提取工艺稳定可靠。通过紫外和傅里叶变换红外光谱扫描发现，白英粗多糖具有典型的多糖光谱吸收峰，其中含有糖醛酸，说明白英多糖可能为酸性多糖。白英粗多糖对DPPH 自由基和ABTS+自由基的半抑制浓度（IC50）分别为1.104、1.408 mg/mL，说明白英粗多糖具有良好的抗氧化活性。本研究为白英粗多糖的提取提供了一种高效的提取方法，为白英多糖的进一步开发提供了理论依据。但白英多糖的主要片段、单糖组成、分子量分布、构象仍有待进一步深入研究。