两歧双歧杆菌FL-228.1 增强小鼠先天免疫功能研究

周 瑜，田晓英，崔庆宇，张 喆，公丕民，林 凯，易华西，刘同杰，张兰威

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266000）

免疫系统包括先天免疫和适应性免疫，在预防、控制感染和维持机体稳态方面发挥重要作用[1]。先天免疫系统的缺陷可导致无法识别病原体和迅速激活免疫反应，从而容易发生严重或复发性感染[2]。作为人体先天免疫防御战线的重要成员，巨噬细胞几乎存在于所有组织中，其主要功能是吞噬细胞碎片和外来病原体，并且活化的巨噬细胞可以分泌细胞因子和趋化因子，从而招募和激活其他免疫细胞[3-4]。自然杀伤（Natural killer，NK）细胞是细胞毒性淋巴细胞的一员，但与T 细胞不同，NK 细胞可以直接识别和解决病毒感染，并在没有预先刺激的情况下自发地裂解肿瘤细胞[5]。此外，潘氏细胞可以产生、储存和分泌多种抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMP），包括α-防御素（在小鼠中称为Cryptdins）、Cathelicidins（在小鼠中称为Cathelin-related antimicrobial peptide，CRAMP）和再生胰岛衍生蛋白3γ（Regenerating islet-derived protein 3 gamma，RegIII-γ）等[6]。总体而言，这些免疫细胞和免疫分子作为先天免疫的重要组成部分，参与了宿主抵抗外部病原体入侵的第一道防线。

益生菌是活的微生物，当给予适当剂量时，会对宿主的健康有益[7]。它们可以提高免疫力，是良好的免疫激活剂[8]。研究表明，益生菌能通过提高NK 细胞活性、调节淋巴细胞亚群和细胞因子的表达等途径改善老年人的免疫力[9]。然而，目前益生菌对普通人群免疫功能的作用还存在争议，且效果上具有菌株和个体差异性。Shida 等[10]研究发现每日摄入干酪乳酪杆菌LcS 能降低健康中年上班族的上呼吸道感染率和持续时间。但在健康女性医护人员中，补充保加利亚乳杆菌OLL1073R-1 发酵的酸奶没有显示出对流感的显著预防作用或NK 细胞活性的增强[11]。同时，益生菌调节免疫功能作用机制尚不清晰，且目前多集中于体外研究。如Rocha-Ramírez 等[12]研究发现乳酸杆菌在体外以TLR2 依赖的方式刺激人源巨噬细胞中促炎细胞因子的表达并促进其对病原体的吞噬作用和杀菌活性。

因此，本文结合体外筛选和体内验证，探究了潜在功能菌株在正常个体中的免疫调节作用，并对效果较好的两歧双歧杆菌FL-228.1 的作用机制进行初步探讨。首先借助RAW264.7 细胞和人外周血单核细胞（PBMCs），从8 株菌中筛选出最具先天免疫调节潜力的菌株并进一步在正常小鼠体内从免疫细胞活性、细胞因子和免疫分子抗菌肽的表达等方面综合评价其对先天免疫系统的影响并对可能的作用机制进行探讨，以期为益生菌作为免疫增强食品的开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

RAW264.7 细胞、K562 细胞、YAC-1 细胞 中国科学院细胞库；BALB/c 雌性6 周龄小鼠 北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2021-0006；实验所用菌株：两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）FL-228.1 和动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalissubsp.animalis）F1-7 来源于健康婴儿粪便；副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）K14、X11，鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）MN45、FN518 和植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）FWDG 来源于传统发酵乳制品；阴道乳杆菌（Lactobacillus vaginalis）MN11 来源于产道拭子 保藏于中国海洋大学功能性乳品与益生菌工程实验室；干酪乳酪杆菌LC（Lacticaseibacillus casei）从市面上有增强免疫力功能的产品中分离；MRS 液体培养基 青岛海博生物技术有限公司；RPMI 1640 培养基、DMEM 高糖培养基、SDS 溶液、刀豆蛋白A（ConA）、台盼蓝染色液、PBS 缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；中性红染色液、青霉素-链霉素混合溶液、TritonX-100上海碧云天生物技术有限公司；特级胎牛血清BI 生物科技公司；Ficoll-Hypaque 分离液 天津灏洋生物科技有限公司；Trizol 裂解液 南京诺唯赞生物科技有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix、逆转录试剂盒 东洋纺生物科技有限公司；TNF-α、IL-10、IL-12、IFN-γ和IgG 试剂盒 苏州卡尔文生物科技有限公司。

LRH-250 生化培养箱 上海一恒仪器有限公司；MW80 二氧化碳培养箱 上海皓庄仪器有限公司；VARIOSKAN FLASH 全波长多功能酶标仪、NanoDrop2000 超微量分光光度计 赛默飞世尔科技公司；BIO-RAD CFX96 实时荧光定量PCR 仪美国BIO-RAD 公司；TP600PCR 扩增仪 宝日医生物技术有限公司；TG20KR-D 高速冷冻离心机 长沙东旺实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养 实验所用菌株储存在-80 ℃冰箱，室温解冻后按1%（v/v）接种量分别接种于MRS液体培养基，37 ℃厌氧培养24 h。取活化第三代的菌株在4 ℃，8000 r/min 下离心10 min，收集菌体，用PBS 缓冲液洗涤三次，最后用PBS（动物实验）或细胞培养基（细胞实验）重悬至实验所需浓度，其中以LC 作为参考菌株。

1.2.2 PBMCs 分离培养 从10 名18～30 岁的健康志愿者中抽取空腹血样，得到了所有受试者的知情同意。使用Ficoll 密度梯度离心法分离PBMCs[13]，将得到的细胞进行台盼蓝染色，当PBMCs 活力大于95%时，用于后续实验。

1.2.3 RAW264.7 细胞吞噬活性测定 如前所述，采用中性红法检测巨噬细胞吞噬活性，并稍做修改[14]。用DMEM 高糖培养基调整细胞浓度为1×106个/mL，以菌:细胞=10:1 的浓度培养细胞24 h 后，向每孔加入200 μL 1%中性红染色液。继续培养0.5 h 后用PBS 洗涤三次，每孔加入200 μL 裂解液（冰醋酸:无水乙醇体积比为1:1），4 ℃静置过夜，用酶标仪测540 nm 下吸光度值。

1.2.4 NK 细胞活性测定 如前所述，采用乳酸脱氢酶释放法检测NK 细胞活性，并稍做修改[15]。用2×107CFU/mL 的菌悬液干预PBMCs 24 h。用RPMI 1640 培养基调整K562 细胞浓度为2×105个/mL，按效靶比为50:1，将PBMCs（效应细胞）和K562 细胞（靶细胞）各100 μL 加入U 型96 孔培养板，同时设自然释放孔加靶细胞和含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基各100 μL，最大释放孔加靶细胞和2.5%TritonX-100 各100 μL。37 ℃，5% CO2下培养4 h，1500 r/min 离心5 min，每孔吸取100 μL 上清液，同时加入100 μL LDH 基质液，反应5 min，随后每孔加入30 μL 1 mol/L 的HCL 溶液终止反应，在490 nm处测OD 值，NK 细胞活性计算公式如下：

1.2.5 动物模型与分组 30 只BALB/c 小鼠在清洁级、12 h 光照/黑暗交替、（22±2）℃温度、（55%±5%）相对湿度的动物房适应性喂养7 d，随后被随机分成3 组（n=10），分别为空白对照组（Control 组）、FL-228.1 干预组和LC 干预组，所有组别小鼠均喂食普通饲料。实验按照中国科学技术部动物管理条例，并经中国海洋大学食品科学与工程学院实验动物伦理委员会批准（批准号：SPXY2021112402）。实验设计为：空白对照组每天灌胃0.2 mL PBS，菌株干预组每天灌胃0.2 mL 菌悬浮液（5×108CFU/mL），实验持续28 d。

1.2.6 小鼠血清及组织处理 小鼠禁食不禁水12 h，称重，麻醉，眼球取血，室温放置30 min 后3000 r/min离心15 min，小心吸取上层淡黄色血清分装保存。取脾脏和胸腺，用生理盐水清洗，滤纸吸干表面水分后称重，分别计算脾脏和胸腺与小鼠体重的比值。

1.2.7 腹腔巨噬细胞吞噬活性测定 将5 mL RPMI 1640 培养基注入腹腔，轻轻按压2 min，提取腹腔液体到离心管中，1500 r/min 离心5 min。弃去上清液，调整浓度至1×106个/mL，培养24 h 后弃去液体，其余同1.2.3。

1.2.8 NK 细胞活性测定 取出小鼠脾脏，制成浓度为2×106个/mL 的脾细胞悬液作为效应细胞。按效靶比为50：1，将脾细胞（效应细胞）和YAC-1 细胞（靶细胞）各100 μL 加入U 型96 孔培养板，其余同1.2.4。

1.2.9 ConA 诱导的脾淋巴细胞转化实验 实验方法如前所述[16]，将脾细胞悬液（5×106个/mL）接种到有/无75 μL ConA 作为T 细胞刺激剂的24 孔板中，培养68 h 后，每孔吸走0.7 mL 培养基，加入50 μL 5 mg/mL MTT 和0.7 mL 不含胎牛血清的RPMI 1640培养基。培养4 h 后，每孔加入1 mL 3% SDS 溶液溶解紫色晶体，用酶标仪测定570 nm 处OD 值。用有/无Con A 的OD 值之差代表转化能力。

1.2.10 小鼠血清细胞因子和IgG 测定 用酶联免疫吸附法按照试剂盒说明书检测血清中TNF-α、IL-10、IL-12、IFN-γ和IgG 的含量。

1.2.11 RT-PCR 检测抗菌肽相关基因的mRNA 表达 利用RT-PCR 方法，加入Trizol 裂解液从回肠组织中提取总RNA。通过逆转录试剂盒合成cDNA单链后进行qPCR 操作。所用引物委托上海生工生物工程有限公司设计并合成，序列如表1 所示，2-ΔΔCt用于计算基因表达的倍数。

表1 逆转录聚合酶链反应的引物序列Table 1 Primer sequences of reverse transcription polymerase chain reaction

1.3 数据处理

所有实验均至少重复3 次，结果均用平均值±标准差形式表示，数据使用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，组间差异检验采用Duncan 检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。数据图采用Prism 8.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 不同菌株干预对先天免疫细胞活性的影响

2.1.1 不同菌株干预对RAW264.7 细胞吞噬活性的影响 RAW264.7 细胞来源于具有巨噬细胞特性的BALB/c 小鼠细胞，其被认为是体外研究巨噬细胞功能的合适模型[17]。因此，在本研究中，通过中性红法检测不同菌株干预对RAW 264.7 细胞吞噬作用的影响。结果如图1A 所示，与空白组相比，用不同菌株处理的RAW264.7 细胞吞噬活性均显著提高，增长超过51.11%，其中FL-228.1、FWDG、FN518、X11 和MN45 表现效果优于LC 对照组（P<0.05）。与此相一致的是，Rocha-Ramírez 等[12]的研究也显示所有菌株干预均能增强巨噬细胞的吞噬作用，但瑞士乳杆菌IMAU70129 和干酪乳酪杆菌IMAU60214 效果最优，这表明不同菌株对巨噬细胞的吞噬作用具有差异性。

图1 益生菌对RAW264.7 细胞吞噬活性和NK细胞活性的影响Fig.1 Effects of probiotics on phagocytic activity of RAW264.7 cells and NK cell activity

2.1.2 不同菌株干预对NK 细胞活性的影响 益生菌的免疫作用不仅限于肠道，已有研究发现益生菌干预能提高人外周血中NK 细胞活性[18]。本研究在PBMCs 中检测不同菌株干预后人原代NK 细胞活性的变化，结果如图1B 所示，与空白组相比，仅两歧双歧杆菌FL-228.1 和鼠李糖乳酪杆菌FN518 能显著提高NK 细胞活性（P<0.05），增长超过51.2%，增强效果与LC 对照组相当，其具体作用机制尚需进一步研究，可能是通过促进细胞因子分泌进而刺激NK 细胞活化[19-20]。

2.2 两歧双歧杆菌FL-228.1 干预小鼠调节先天免疫的效果

2.2.1 两歧双歧杆菌FL-228.1 对小鼠体重和免疫器官指数的影响 基于细胞实验的结果，进一步进行动物实验评价FL-228.1 在体内调节先天免疫的效果。由表2 可知，实验期间小鼠体重增长正常，各组间小鼠最终体重无显著性差异（P>0.05），表明口服菌株FL-228.1 对动物生长安全性良好[21]。与空白组相比，各组小鼠的脾脏指数无明显变化（P>0.05），FL-228.1干预可以显著增加小鼠的胸腺指数（P<0.05）。而脾脏指数和胸腺指数是反映免疫器官发育的重要指标，其状态直接影响机体免疫功能和抗病能力[22]，故口服FL-228.1 菌悬液可以促进胸腺发育。

表2 各组小鼠体重及脏器/体重比值的比较Table 2 Comparison of body weight and organ/body weight ratio of mice in each group

2.2.2 两歧双歧杆菌FL-228.1 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响 巨噬细胞的吞噬功能在某种程度上是免疫反应中不可或缺的步骤[23]。由图2A 可知，与空白组和LC 对照组相比，补充FL-228.1 能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性（P<0.05），增长超过一倍。Lee 等[24]研究表明这种增强作用是通过激活巨噬细胞表面TLR2 进而导致细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）的活化所介导，据此推测FL-228.1 可能也是通过这种信号级联反应发挥免疫促进作用。

图2 益生菌对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性、NK 细胞活性和脾淋巴细胞转化的影响Fig.2 Effects of probiotics on phagocytic activity of peritoneal macrophages,NK cell activity and splenic lymphocyte transformation

2.2.3 两歧双歧杆菌FL-228.1 对小鼠NK 细胞活性的影响 NK 细胞来源于骨髓，主要存在于血液和淋巴组织，特别是脾脏中[25]。实验结果如图2B 所示，摄入FL-228.1 能显著提高小鼠脾脏处NK 细胞对癌细胞的杀伤活性（P<0.05）。具体而言，当NK 细胞识别癌细胞后，会调动细胞毒性颗粒向免疫突触移动并将其释放到细胞间隙，破坏靶细胞完整性，进而诱导细胞凋亡[26]。Cheon 等[27]研究发现脱颗粒抑制剂刀豆素A 预处理能有效阻断嗜酸乳杆菌La205 诱导的NK 细胞活性，故菌株FL-228.1 对NK 细胞活性的增强最终可能是通过促进NK 细胞的颗粒胞吐作用实现的。

2.2.4 两歧双歧杆菌FL-228.1 对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响 T 淋巴细胞受到Con A 刺激后会转化为母细胞持续增殖[28]。当T 细胞表现出低活性或免疫缺陷时，其转化率下降，免疫功能降低[29]。由图2C可知，补充FL-228.1 可以显著提高小鼠脾淋巴细胞转化率（P<0.05），增强细胞介导的免疫。Ren 等[29]的实验结果也显示小鼠连续摄入1×108CFU 的植物乳植杆菌Lp 能显著促进脾淋巴细胞转化，并且其所用剂量与本研究一致，表明补充特定菌株能对机体适应性免疫产生积极作用。

2.2.5 两歧双歧杆菌FL-228.1 对小鼠血清细胞因子和IgG 的影响 先天免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞，可以通过释放大量的细胞因子和趋化因子与其他细胞产生联系，从而协调免疫反应[30]。在本研究中检测血清细胞因子变化，结果如图3A～图3D 所示，各组间TNF-α、IL-10、IL-12 和IFN-γ水平无显著差异（P>0.05）。由于IL-10 与IL-12 的比值是确定免疫反应方向的关键，而IL-10 和TNF-α的相对平衡对于控制免疫偏差至关重要[31]。因此推测这一实验结果可能是摄入菌株后促炎细胞因子和抗炎细胞因子在外界刺激下保持平衡的结果，从而使机体在保持警惕的同时，不会产生过度的免疫反应。先前的一项研究也有相似的发现，分别给每只小鼠灌胃5×108CFU 和1×109CFU 的植物乳植杆菌CGMCC1.557不会引起血清IL-10、IFN-α和IFN-γ含量的显著变化[32]。IgG 是再次免疫应答的主要抗体，也是唯一一种可以穿过胎盘保护胎儿的抗体，其存在于所有体液中[16]。由图3E 可知，补充FL-228.1 后血清中IgG的含量显著增加（P<0.05），进而提高小鼠体液免疫功能。

图3 益生菌对小鼠细胞因子和IgG 的影响Fig.3 Effects of probiotics on cytokines and IgG in mice

2.2.6 两歧双歧杆菌FL-228.1 对小鼠抗菌肽相关基因mRNA 表达的影响 潘氏细胞是位于肠隐窝底部的小肠上皮细胞，其分泌的抗菌肽类似于分泌型免疫球蛋白A[33]。这些抗菌肽是真核生物中广泛存在的重要先天免疫分子，其可以有效攻击和杀灭潜在的有害微生物[34]。在本研究中，取小鼠末端回肠进行抗菌肽相关基因的检测。结果如图4 所示，与空白组相比较，补充FL-228.1 能够显著上调Cryptdin-4 和CRAMP 的基因表达（P<0.05），其增强效果与LC 对照组相当，但对RegIII-γ的mRNA 表达无显著影响（P>0.05）。与此相反的是，Hrdý等[35]发现罗伊氏粘液乳杆菌而非动物双歧杆菌可以显著提高小鼠RegIII-γ的基因表达，但Cryptdin-4 的mRNA 水平无明显变化。另有研究发现，芽孢杆菌LF4 通过TLR 和NLR 信号诱导肠上皮细胞中抗菌肽的基因上调[36]，这些研究表明菌株促进抗菌肽表达的效果具有差异性，而模式识别受体可能在此过程中发挥重要作用。

图4 益生菌对小鼠回肠抗菌肽相关基因mRNA 表达的影响Fig.4 Effects of probiotics on mRNA expression of antimicrobial peptide-related genes in mouse ileum

3 结论

本研究通过体外细胞筛选和动物实验得到一株在提高先天免疫细胞活性方面表现效果最好的两歧双歧杆菌FL-228.1，并从提高免疫细胞活性、调节细胞因子表达和促进免疫分子抗菌肽相关基因的上调等方面对其免疫调节能力进行了表征。本研究表明，两歧双歧杆菌FL-228.1 能调节先天免疫系统，同时对适应性免疫具有积极影响，并使机体处于免疫平衡状态而不产生过度反应，这为益生菌作为免疫增强食品的开发提供理论基础，未来具有广泛的应用前景。同时，本研究中两歧双歧杆菌FL-228.1 增强机体先天免疫力的具体作用机制还有待深入的研究。