蚕蛹源肽锌纳米粒子的制备及其结构表征

廖明君，张自然,，惠 森，陈璐雯，杨春媛，张宗凯，牛改改

（1.北部湾大学食品工程学院，广西高校北部湾海产品高值化利用与预制食品重点实验室，广西钦州 535011；2.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 535000）

锌是人体必需的微量元素，参与调节细胞生长、基因表达和免疫反应等生理活动，在生命活动中起着重要的作用，锌的缺乏可导致生长迟缓和免疫功能受损[1]。据报道，目前全球约17%的人群出现锌缺乏症状，缺锌已成为影响全球性人类健康的一大诱因[2]。造成机体缺锌的主要原因是日常膳食中锌的生物利用度低，如锌易与植酸形成不溶性复合物，而无法被肠道吸收[3]。因此，开发有效的补锌剂具有重要的理论和现实意义。

传统上的补锌剂如硫酸锌、葡萄糖酸锌等往往存在易在微碱性环境下沉淀、生物利用度低，以及刺激胃肠道等缺点，不宜长期使用[2]。而食源性蛋白肽可与锌形成螯合物，相比无机锌具有稳定性好、安全、易吸收等优点而成为有效补锌的一种重要形式，具有广阔的应用前景。目前国内外学者已利用动植物蛋白为原料酶解而得多肽，制备出多种肽锌螯合物，如Zhang 等[4]通过在牡蛎蛋白酶解液中加入硫酸锌，成功制备得到肽锌纳米粒，并对其溶解性、胃肠稳定性和结合机制进行了探讨，结果显示肽锌纳米粒在胃肠道中的溶解性和稳定性显著优于硫酸锌；Peng 等[5]利用南瓜籽制备得到两条肽锌螯合物在胃肠稳定性和促锌吸收效果方面显著优于无机锌。因此，开发食源性肽补锌制剂具有重要的现实意义。

我国桑蚕业历史悠久，是世界蚕桑生产第一大国，蚕蛹年产量高达65 万吨[6]。蚕蛹富含蛋白质，且氨基酸组成均衡，是人体理想的蛋白来源。近年来，以蚕蛹蛋白为原料，制备得到多种生理活性肽。例如，Li 等[7]采用碱提取法获得蚕蛹蛋白，发现采用超声波粉碎-碱性蛋白酶酶解制备得到酶解液对小鼠脾细胞显示了促增殖效果；沈圆圆等[8]利用纳豆菌液态发酵法成功制备了蚕蛹抗炎活性多肽。其中，相对于其它方法，酶解法制备蚕蛹肽具有操作简便，酶切位点可控等优点，应用前景广阔[9]。

目前，蚕蛹主要作为动物饲料使用，部分用于食品加工，产品有蛋白粉、氨基酸和蛋白纤维等，尚未得到有效的开发利用。国内外学者普遍认为肽中的组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asp）和蛋氨酸（Met）与其金属螯合能力密切相关[10]。资料显示，蚕蛹蛋白质中富含Asp 和Glu 等带电氨基酸，分别约占总氨基酸量的10%和14%[11]，可为金属提供丰富的结合位点，提示其中蕴含锌螯合肽片段，是制备肽锌螯合物的良好原料。然而，目前尚未见蚕蛹肽锌螯合物的相关报道。因此，本文以蚕蛹为原料，利用可控酶解技术制备活性肽，探索蚕蛹肽锌螯合物的制备工艺参数，并借助紫外光谱、荧光光谱、粒径分析、红外光谱及扫描电镜等技术手段进行结构表征，期望为补锌制剂的开发及蚕蛹的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蚕蛹 广西靖西鑫晟茧丝绸科技有限公司；甘氨酸、苯并戊三酮（茚三酮）、七水合硫酸锌 分析纯，上海国药制药集团；碱性蛋白酶 8.6×105units/g，丹麦诺维信公司；其他分析试剂均为国产分析纯；MD34-500 透析袋 西安优博生物科技有限公司。

iCE 3500 AA 原子吸收光谱仪、Lumina 荧光光度计 美国Thermofisher 公司；纳米粒度及Zetasizer NANO-ZS Zeta 电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司；高分辨场发射扫描电子显微镜 德国Zeiss 公司；Vario EL cube元素分析仪 德国Elementar 公司；Fnortier-TGA4000红外光谱仪 北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蚕蛹肽的制备

1.2.1.1 蚕蛹蛋白的提取及预处理 参照Zhou 等[12]的方法使用正己烷脱脂，并采用碱溶酸沉法提取蚕蛹蛋白质，即于脱脂蚕蛹粉中加入氢氧化钠溶液（1 mol/L），质量体积比为1:10，45 ℃搅拌5 h，离心（8000 r/min，10 min）取上清液，用1 mol/L 盐酸调pH 至4.0，室温搅拌10 min，离心（8000 r/min，10 min），取沉淀，用500 Da 透析袋透析除盐后，冻干备用，即为蚕蛹蛋白。参照任子旭等[13]的方法对蚕蛹蛋白进行超声波改性处理，具体操作如下：在（30±5）℃条件下，用超声功率为530 W 的超声波对浓度为50 g/L 的蚕蛹蛋白溶液处理35 min。

1.2.1.2 蚕蛹肽的制备 参考赵梓月等[14]的方法利用碱性蛋白酶制备蚕蛹多肽。将经过超声波处理的蚕蛹蛋白溶液用蒸馏水配制成质量浓度为10 g/L 的悬浮液，加入1% 碱性蛋白酶，调整pH8.0，于50 ℃恒温水摇床中酶解（140 r/min）。酶解结束后，100 ℃水浴灭酶10 min，冷却至室温，离心（8000 r/min，10 min），取上清液，备用。通过对比不同酶解时间（0，2，4，6，8，10，12 h）下酶解液对锌螯合率的变化，确定适宜的酶解参数。将此条件下制备的酶解液进行膜过滤（0.45 μm，混合纤维膜）处理，调节蠕动泵转速使膜板出口压力稳定在0.2 MPa。收集小于10 kDa 组分进行冻干备用，即为螯合用蚕蛹肽（Silkworm Chrysalis Peptide，SCP），于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 蚕蛹肽锌螯合物的制备 取一定体积的10 mg/mL SCP 水溶液与一定的体积的硫酸锌（ZnSO4，100 mg/mL）混合，调整至一定的pH，置于恒温水浴摇床（140 r/min）中反应至所需时间。取出后冷却，加入3 倍体积的无水乙醇，4 ℃静置过夜，离心（8000 r/min，10 min），去除上清液，加入乙醇清洗沉淀3 次以上，直至用氯化钡检测无硫酸根检出为止，冻干，备用。

1.2.3 不同因素对蚕蛹肽螯合锌能力的影响 为寻找蚕蛹肽锌螯合的最佳工艺参数，本研究对ZnSO4的质量比（1:0.125、1:0.25、1:0.33、1:0.5、1:1、1:2、1:3）、pH（3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0）、螯合时间（20、40、60、80、100 min）以及温度（25、35、45、55、65 ℃）等因素对螯合能力的影响进行分析，以期得到蚕蛹肽锌螯合物的最佳制备工艺。首先，在温度50 ℃，pH 6.5，分别加入不同剂量的硫酸锌，反应20 min，进行螯合率的测定。并在此基础上，探究不同pH、螯合时间以及温度下肽对锌螯合率的变化。将最优条件下制备的肽锌螯合物（Silkworm Chrysalis Peptide-Zinc，SCP-Zn）冻干，备用。

1.2.4 水解度的测定 采用茚三酮法测定水解度[15]。取0.5 mL 待测样品，加入蒸馏水补足至2.0 mL，加入茚三酮试剂1.0 mL，立即摇匀，沸水浴15 min，冷却至室温，然后加入5.0 mL 40%乙醇，摇匀后，立刻于570 nm 处测定吸光度值。使用蒸馏水为空白参比。采用甘氨酸制作标准工作曲线。水解度计算公式见下式：

式中：h 表示被水解的肽键数；htot表示蛋白质总肽键数；Ch表示酶解液中的氨基含量，μmol/L；Cm表示原料蛋白质中游离氨基的含量，mmol/g；N 表示酶解液蛋白含量，mg/mL；6.25 表示蛋白换算系数；蚕蛹的htot=8.09[16]。

1.2.5 锌螯合能力的测定 肽锌螯合能力的测定用螯合率来表示，螯合率（%）=（螯合锌含量/总锌含量）×100。

锌含量的测定采用GB 5009.14-2017 原子吸收法。其中，螯合锌的提取采用乙醇沉淀法，如1.2.2所述。

1.2.6 蚕蛹肽锌螯合物的结构表征

1.2.6.1 紫外光谱分析 向20 mL 5 mg/mL SCP 溶液中分别加入不同量的ZnSO4，使Zn2+浓度为0、1、2、4、8、16 mmol/L，室温反应30 min 后，过0.45 μm混合纤维膜，取滤液备用。分别采用全自动紫外扫描仪于200～500 nm范围内分别进行全波长扫描，考察锌的加入量对蚕蛹肽中的分子外层电子跃迁情况的影响，进而探究肽锌螯合情况，采用去离子水调零。

1.2.6.2 荧光光谱分析 向20 mL 5 mg/mL SCP 溶液中分别加入不同量的ZnSO4，使Zn2+浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mmol/L，室温反应30 min 后，过0.45 μm 混合纤维膜，取滤液备用。采用荧光光谱仪测定锌对肽内源荧光及肽构象的影响。测定条件如下：激发波长为280 nm，发射波长为300～500 nm，裂缝宽度为10 nm，PMT 为450 V[4]。

1.2.6.3 形貌观察 采用高分辨率场发射扫描电镜测定新鲜制备的SCP 和SCP-Zn 的表面形貌。即将待测样冻干粉均匀喷涂于导电胶上，喷金后采用FESEM 观察形貌。

1.2.6.4 元素组成分析 采用元素分析仪测定元素组成。样品前处理与形貌观测处理方法相同。

1.2.6.5 粒度分析 采用动态光散射技术（DLS）在Nano-ZS 上测定SCP-Zn 的粒径分布和多分散系数（PDI）。采用超纯水作为分散液稀释样品至1 mg/mL，于25 ℃下进行测定，每个样品至少平行测定三次以上。

1.2.6.6 傅里叶变换红外光谱分析 采用傅里叶变红外光谱仪对SCP-Zn 的二级结构进行测定，测定方法参考Van 等[17]和蔡沙等[18]的方法进行改进。各取约25 mg SCP-Zn 冻干粉及SCP 冻干粉分别与225 mg 溴化钾在研钵中磨匀，压成薄片后放入红外光谱仪进行扫描，扫描波长范围为400～4000 cm-1，连续扫描128 次，分辨率为2 cm-1。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0 软件对数据进行方差分析与显著性分析，P<0.05 表示差异显著，采用Origin 软件制图。

2 结果与分析

2.1 酶解时间对肽锌螯合物形成的影响

以水解度和螯合率为指标考察酶解时间对肽锌螯合物形成的影响，如图1 所示。结果显示，随着酶解时间的延长，水解度先逐渐增加后趋于稳定，这符合酶解反应的趋势[18]；同时，肽对锌的螯合率随着酶解时间的延长，呈现先增长后下降的趋势，6 h 酶解液对锌的螯合率最大（58.05%），显著高于其它时间点（P<0.05）。天然蛋白质内部蕴藏着丰富的生理活性肽段，酶解处理可有效将这些肽段释放出来，而酶的种类及酶解时间等酶解条件，直接影响着肽的种类及数量，最终决定了酶解液对锌的螯合能力。碱性蛋白酶来源于枯草杆菌，作为一种丝氨酸内切酶，酶切位点广，被广泛用于金属螯合肽的制备[19]，因此本研究选择碱性蛋白酶作为蚕蛹蛋白水解用酶。一方面，酶解时间是影响酶解产物锌螯合能力的重要因素，如分别以芝麻蛋白[20]、牡蛎蛋白[4]和米糠蛋白[21]为原料，所制备的酶解液的螯合能力随着酶解时间呈现先增长后下降的趋势，与本研究结果一致。这可能是由于酶解反应会释放金属螯合位点；另一方面，随着酶解反应的持续进行，锌螯合位点与酶解液中的其他组分发生结合，如半胱氨酸的巯基作为金属螯合位点之一，易在酶解过程中发生氧化，而丧失金属螯合能力[22]。从图1 可以看出，蚕蛹蛋白的水解度与其对锌的螯合能力存在密切关系，酶解6 h 为蚕蛹锌螯合肽的最佳制备时间。

图1 酶解时间对肽锌形成能力和水解度的影响Fig.1 Effects of hydrolysis time on silkworm peptide-zinc complexation and degree of hydrolysis

2.2 蚕蛹肽锌纳米粒的制备工艺优化

为提高SCP-Zn 的制备效率，本研究对蚕蛹肽锌螯合条件进行探索，如图2 所示。从图2 中可以看出，肽锌质量比、pH 及温度对SCP 和锌的螯合反应影响十分显著，而反应时间则无显著影响。随着SCP与ZnSO4质量比从1:0.125 增加至1:0.33，肽对锌的螯合能力保持稳定，于1:0.5 时螯合率骤然降至66.3%（图2A）。这说明蚕蛹肽对锌的螯合位点有限，当质量比为1:0.5 时，肽中对锌的螯合位点已全部被Zn2+占据。因此，当继续增加ZnSO4时，螯合锌的质量并不会持续增加。为保证有足够的Zn2+与蚕蛹肽结合形成螯合物，后续选择肽锌质量比为1:0.5进一步优化螯合物制备工艺。从图2B 可知，pH 是影响肽和锌形成螯合物的重要参数。在不同pH 下（3.0～8.0），蚕蛹肽对锌的螯合能力变化显著（P<0.05）。首先，随着pH 从3.0 增加至6.5，肽锌螯合能力逐渐增加，并于pH6.5 时达到最大值（66.5%）。这可能是由于在酸性条件下，溶液中的H+与Zn2+竞争反应位点，阻碍了肽与锌的螯合[23]。另外，当pH>6.5 时，溶液中的OH-与Zn2+结合，形成沉淀，从而导致螯合率下降[24]。因此，pH6.5 为蚕蛹肽锌螯合的最适pH，该结果与Zhang 等[4]的研究结果一致。图2C 为反应时间对蚕蛹肽螯合锌能力的影响，结果显示，孵育时间对肽锌螯合能力无显著影响（P>0.05）。因此，选择20 min 为最佳螯合时间。由图2D 可知，温度对蚕蛹肽锌螯合能力影响较大。随着温度的增加，蚕蛹肽对锌的螯合能力也随着增加，并于55 ℃时达到最大值（72.63%），随后下降。肽锌螯合属于吸热反应，因此，在25～45 ℃内，适当的加热有助于螯合反应的反应速率和平衡系数增大，利于螯合反应的进行与肽的折叠和重组，从而使得肽锌螯合能力增加；而过度加热会造成多肽变性，多肽中的配合位点丢失，从而导致肽锌螯合能力的下降[25]。因此，螯合温度选择55 ℃进行后续的螯合工艺优化试验。

图2 不同螯合条件对SCP 的锌螯合能力影响Fig.2 Effects of different chelating conditions on the zincbinding capacity of SCP

因此，本研究确定最佳螯合工艺条件如下：SCP 与ZnSO4质量比为1:0.5，pH6.5，时间20 min，温度为55 ℃。

2.3 蚕蛹肽锌螯合物的结构表征

2.3.1 紫外光谱分析 图3 为在SCP 中加入不同剂量的ZnSO4后所得紫外扫描光谱图。SCP 在202 nm出现强吸收峰；在288 nm 处出现一个弱吸收峰。这两个吸收峰分别是由肽键上的发色基团（C=O）n→π*、π→π*电子跃迁和酪氨酸的苯环引起[17]。随着ZnSO4的加入，这两个吸收峰发生了移动和强度逐渐减弱的现象。如，最大吸收峰移至198 nm；288 nm 处的峰值随着络合反应的进行逐渐蓝移至287 nm，且吸光度值明显降低，这表明SCP 中的发色基团（-C=O，-COOH）和助色基团（-OH，-NH2）因参与了螯合反应而发生偏振变化[26]。大豆肽-锌螯合物[27]和花生肽-锌螯合物[28]也呈现出相似的紫外光谱变化。这说明SCP 与锌发生了螯合反应。

图3 Zn2+的剂量对SCP 紫外可见光谱的影响Fig.3 Effect of zinc dosage on the Ultraviolet-visible spectrum of SCP

2.3.2 荧光光谱分析 由于蛋白质中含有苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）等可在一定波长下激发产生内源荧光的氨基酸，当蛋白质或多肽结构发生改变，如折叠或与小分子物质结合后，荧光强度即会发生改变，因此内源荧光强度的变化能够间接反映蛋白质或肽与Zn2+的结合程度[29]。图4 为Zn2+对SCP 荧光光谱的影响，随着Zn2+的增加，SCP 荧光光谱峰峰值逐渐降低，最终峰值趋于稳定。图中，随着Zn2+浓度从0 增加至9 mmol/L，样品荧光强度从1217.8 降低到804.0。其中，当1 mmol/L Zn2+加入时，样品的内源荧光强度下降幅度最大。资料显示，蛋白质或肽与金属螯合时易发生折叠，聚集现象，从而导致内源荧光淬灭[26,30]。同时，由于肽的螯合位点有限，图4 显示，Zn2+浓度达到8 mmol/L 时，继续增加Zn2+的量，荧光强度值无明显变化，说明此时SCP 中的金属螯合位点完全被占据。该结果与Meng等[31]报道一致，即Zn2+的引入会使得罗非鱼胶原蛋白肽的内源荧光强度降低。

图4 Zn2+的剂量对SCP 荧光光谱的影响Fig.4 Effect of zinc dosage on fluorescence spectrum of SCP

2.3.3 形貌观察及元素组成分析 从图5 可以看出，SCP 和SCP-Zn 的表面形貌有显著不同。SCP 呈现光滑的片状，而SCP-Zn 呈颗粒状结构，且粒径均匀。造成这一变化的主要原因是金属离子与肽存在很强的相互作用，二者结合造成了肽的聚集。研究显示Zn2+会加速肽的二聚反应，并稳定二聚体的结构，该聚合作用的作用力主要为分子间作用力、表面张力以及晶体的各向异性，而肽链中参与聚合的基团主要是-SH、-COOH 和-NH，三者通过分子间氢键参与聚合反应[5,8,22]。此外，肽链中的氨基可与Zn2+结合发生脱水后形成环状结构，使得肽中的亲水基团被隐藏于聚集体内部，从而造成SCP-Zn 具有一定的疏水性[32]。

图5 SCP 和SCP-Zn 的扫描电镜图（SEM）Fig.5 SEM images of SCP and SCP-Zn

SCP 和SCP-Zn 的表面元素组成分析显示，两个样品中均含有Cl、C、N、O、Na、Zn、P、S 和K 等元素。为了便于分析肽锌螯合前后肽与锌组成比例的变化，特将C、N、O、Zn 四种元素提取出来，并计算质量百分比，如表1 所示。SCP 中C、N、O 三种元素占比高达99.87%，Zn 仅占0.13%，而SCPZn 中C、N、O 三种元素占比为62.54，锌含量高达37.46%。这说明，肽与锌的成功螯合大大提高了肽中锌的含量。

表1 SCP 和SCP-Zn 的表面元素组成相对含量（%）Table 1 Surface elemental compositions of SCP and SCP-Zn (%)

2.3.4 粒径分析 粒径大小依赖于粒子的体积大小，是表征待测物质物理性质的一个重要参数。表2 显示，SCP 和SCP-Zn 的平均粒径分别为153.36±2.31（PDI：0.35±0.01）和71.99±0.67 nm（PDI：0.27±0.05）。与SCP 相比，SCP-Zn 的粒径显著降低，且分布更加集中，这说明在SCP 和Zn2+螯合后发生了折叠、聚集，该结果与荧光光谱结论一致。另外，SCP-Zn 的PDI 值小于SCP，进一步证实SCP-Zn 粒径分布更为集中。Zheng 等[33]在椰子饼球蛋白肽-Zn 螯合物中也发现了类似的现象。

2.3.5 红外光谱分析（FTIR）FTIR 是表征肽锌螯合物结合机制的一种有效方法，峰强度变化及位移可以反映肽与金属离子之间的作用位点[24]。为更好的阐明SCP 与Zn 的螯合作用，本研究运用FTIR 对SCP 和SCP-Zn 进行检测。如图6 所示，与SCP 相比，SCP-Zn 的红外光谱图发生了明显变化，如由 NH 伸缩振动和O-H 伸缩振动产生酰胺A 吸收峰从3303 cm-1移至3273 cm-1，饱和碳的 C-H 吸收峰2934 cm-1消失，主要由-C=O 伸缩振动引起酰胺I 带（1700～1600 cm-1）由1650 cm-1移至1604 cm-1，主要反映N-H 弯曲振动及 C-N 伸缩振动的酰胺II带（1600～1500 cm-1）由1556 cm-1移至1524 cm-1，-COO-由1408 cm-1移至1417 cm-1，而酰胺III 带作为C-N 伸缩振动及N-H 平面内弯曲振动的主要反映[34]，由1239 cm-1移至1244 cm-1，-C-O 吸收峰由1022 cm-1移至1042 cm-1。这说明，SCP 中含有-COOH、-C=O 及-NH2，而SCP-Zn 中肽的FTIR 谱图峰强度及位置的变化说明这些基团参与了螯合反应，是SCP-Zn 的主要螯合位点[35]。国内外研究学者普遍认为肽中氨基酸残基的羧基是金属螯合的主要位点[36]。如Ca2+与海参卵肽的螯合位点、Zn2+与玉米肽的螯合位点均为-COOH、-NH2、-C=O[37-38]，Sun等[39]采用FTIR 发现，肽中氨基的N 原子和羧基的O 原子是Zn2+螯合的主要位点。

图6 SCP 和SCP-Zn 红外光谱分析Fig.6 FTIR analysis of SCP and SCP-Zn

3 结论

本研究将蚕蛹肽和Zn2+进行螯合，以螯合率为主要指标，采用单因素实验，确定了蚕蛹肽制备的最佳酶解时间为6 h，肽锌螯合物的最佳制备工艺条件为肽锌比1:0.5、pH6.5、温度55 ℃、时间20 min，此时螯合率达72.63%。对蚕蛹肽与Zn2+螯合前后进行结构表征发现，锌的结合会引起蚕蛹肽发生偏振变化、荧光淬灭、表面形貌及元素组成的改变。SCP-Zn 为一纳米粒子，其表面呈颗粒状结构，锌相对含量高达37.46%。红外光谱发现，Zn2+的主要螯合位点为肽链中的-COOH、-C=O 及-NH2。本研究对丰富有机补锌制剂，开拓蚕蛹加工途径，提升蚕蛹价值提供理论依据。经制备而得的肽锌纳米粒是一混合物，其中的有效活性组分有待于进一步分离、鉴定，其胃肠稳定性及促锌吸收活性尚需进一步研究。