负载褪黑素和枸杞粉的凝胶糖果的研制及特性研究

孙 雯，阎佳楠，来 斌，王 策，吴海涛

（大连工业大学食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁大连 116034）

褪黑素（Melatonin）是一种内源性吲哚胺类分子，由松果体夜间产生，并根据昼夜节律专门释放到血液中[1]，在内分泌和神经系统调节中发挥多种生理功能，包括促进睡眠[2-3]、抗衰老[4]、免疫调节[5]、抗肿瘤等作用[6]。在食品中褪黑素1～3 mg/d 对改善睡眠是安全有效的，已在2020 年纳入最新修订的《保健食品原料目录》中进行备案制管理[7-8]，然而，由于褪黑素水溶性差，生物利用度低，其在功能食品的广泛应用中受到限制[9]。利用玉米醇溶蛋白和果胶多糖通过反溶剂沉淀法负载褪黑素制备成纳米颗粒，可极大程度提高褪黑素等功能因子在应用过程中的稳定性和生物利用度[10]。

凝胶糖果作为一种休闲食品，品种多样，风味各异，具有组织细腻，口感爽滑，货架期长等特点，一直深受国内外消费者的喜爱，然而有关褪黑素类凝胶糖果的应用开发研究还未见报道。明胶是一种常用的食品增稠剂，在糖果生产中，使用明胶较淀粉、琼脂更富有弹性、韧性和透明性，但单一明胶在35 ℃左右易融，需同其他凝胶剂复配使用[11]。卡拉胶是一种硫酸多糖化合物，易吸水溶胀，具有凝胶性能好，成型温度低等优点，可在一定程度改善明胶的热稳定性。与蔗糖相比，糖醇具有低热量、低血糖、低龋齿的特点，因此本实验选择价格更低，口感更好的山梨糖醇和麦芽糖醇作为甜味剂[12]。枸杞是茄科枸杞属植物，其药食同源的历史悠久，是名贵的中药材和高级滋补药品。枸杞的功效成分包括玉米黄素、类胡萝卜素、多种维生素、烟酸等[13]，并具有改善睡眠、抗氧化、抗肿瘤、清肝明目、神经保护和免疫调节作用[14-16]。

随着人们健康认知水平的提升及功能食品对现代生活节奏要求的满足，高品位、低糖度、自然元素调配和营养强化食品越来越受到大众的青睐。本研究将负载褪黑素的玉米醇溶蛋白/果胶纳米颗粒、枸杞粉进行复配，研制一种具有潜在有益睡眠健康的凝胶类食品。通过色差分析、质构分析、低场核磁分析及感官评价，考察了明胶、枸杞粉添加量及烘干时间对凝胶糖果特性的综合影响，为褪黑素凝胶类产品的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

褪黑素 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；玉米醇溶蛋白 美国Sigma 公司；果胶 阿拉丁试剂（上海）有限公司；明胶、卡拉胶、山梨糖醇、麦芽糖醇、无水柠檬酸 食品级，睢县甘淳商贸有限公司；枸杞粉 武汉锦盼食品有限公司。

2KBTES-55 真空冷冻干燥机 美国Virus 公司；JSM-7800F 热场发射扫描电镜 日本电子株式会社；HH-4 数显恒温水浴锅 江苏金坛荣华仪器制造有限公司；CP100NX 高速冷冻离心机 株式会社日立制作所；DHG-9070A 电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；SC-80C 自动色差仪 北京康光有限公司；TA.XT.plus 质构仪 英国SMS 公司；MesoMR23-060V-1 低场核磁 苏州（上海）纽迈电子；DHS-20A 快速水分测定仪 上海舍岩仪器有限公司；UV-1240 紫外可见分光光度计 株式会社日立制作所。

1.2 实验方法

1.2.1 褪黑素纳米颗粒的制备 参考Wang 等[17]的方法并加以改进，取750 mg 玉米醇溶蛋白溶于50 mL体积分数为85%的乙醇溶液中，常温条件下以400 r/min 搅拌1 h，加入40 mg 褪黑素继续搅拌1 h，离心（3000 r/min，10 min）除去不溶性杂质，得到褪黑素/玉米醇溶蛋白分散液，在4 ℃条件下储存备用。取0.1 g 果胶溶于100 mL 去离子水中，在800 r/min的强力搅拌下搅拌过夜，离心（3000 r/min，10 min）取上清液，在4 ℃条件下保存备用。采用反溶剂沉淀法，将4 mL 褪黑素/玉米醇溶蛋白溶液匀速分散至16 mL 的蒸馏水中，分散的同时以800 r/min 的速度磁力搅拌4 min，制得褪黑素/玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液，在40 ℃和0.01 MPa 的压力下使用旋转蒸发器30 min 以蒸发乙醇。随后加入适量的蒸馏水以补偿蒸发造成的体积损失。将褪黑素/玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液倒入20 mL 上述果胶溶液中，以800 r/min 连续搅拌30 min，最终形成负载褪黑素的玉米醇溶蛋白/果胶纳米颗粒分散液（以下简称褪黑素纳米颗粒），经冷冻干燥机冻干72 h 后得到褪黑素纳米颗粒冻干粉，在-80 ℃条件下储存备用。

1.2.2 纳米颗粒粒径和PDI 的测定 在25 ℃条件下通过激光粒度仪测量了新鲜制备的褪黑素纳米颗粒分散液的粒径、多分散指数（PDI）。

1.2.3 微观结构分析 将褪黑素纳米颗粒冻干粉均匀的撒在导电胶上，并进行喷金。采用JSM-7800F热场发射扫描电子显微镜观察负载褪黑素的玉米醇溶蛋白/果胶纳米颗粒的微观结构及形貌。

1.2.4 纳米颗粒褪黑素包埋率的测定 参考Wang等[17]的方法并加以改进，准确称取褪黑素纳米颗粒冻干粉0.1 g 于试管中，加入20 mL 无水乙醇，在室温下超声处理20 min 后，将提取液以5000 r/min 离心10 min，取上清液，用无水乙醇适当稀释后在褪黑素最大吸收波长278 nm 处测其吸光度值，根据标准曲线y=0.0275x-0.0065（R2=0.9997）计算褪黑素含量，按下式计算褪黑素包埋率。

式中：m1为包埋样品中的褪黑素质量，g；m0为加入的褪黑素质量，g。

1.2.5 凝胶糖果工艺流程 参考许粟等[18]的方法并加以改进。

操作要点：准确称量1 g 褪黑素纳米颗粒冻干粉溶于50 mL 去离子水中，搅拌至全部溶解。根据试验配方准确称取枸杞粉、明胶、卡拉胶、山梨糖醇、麦芽糖醇、无水柠檬酸于褪黑素纳米颗粒溶液中，于70 ℃恒温水浴锅中加热20 min，每间隔4 min 搅拌一次。将溶解好的混合液用滴管移取5 mL 至食品级硅胶模具中，4 ℃过夜冷却成型，脱模，在25 ℃条件下干燥后得成品。

经预实验，卡拉胶、山梨糖醇、麦芽糖醇、无水柠檬酸的添加量因所选浓度较低，对凝胶糖果的色差、质构、水分分布没有显著影响，因此本实验将探究枸杞粉、明胶添加量及烘干时间对凝胶糖果综合特性和感官评价的影响。固定明胶添加量为18%，卡拉胶添加量为5%，糖醇添加量为35%（山梨糖醇:麦芽糖醇=1:1），无水柠檬酸添加量为0.8%，烘干时间为18 h（25 ℃），探究不同枸杞粉添加量（0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%）对凝胶糖果综合特性和感官评价的影响；固定枸杞粉添加量为0.4%，卡拉胶添加量为5%，糖醇添加量为35%（山梨糖醇:麦芽糖醇=1:1），无水柠檬酸添加量为0.8%，烘干时间为18 h（25 ℃），探究不同明胶添加量（12%、14%、16%、18%、20%）对凝胶糖果综合特性和感官评价的影响；固定枸杞粉添加量为0.4%，明胶添加量为18%，卡拉胶添加量为5%，糖醇添加量为35%（山梨糖醇:麦芽糖醇=1:1），无水柠檬酸添加量为0.8%，探究不同烘干时间（0、6、12、18、24 h）对凝胶糖果综合特性和感官评价的影响。

1.2.6 色差的测定 使用标准白板将色度计标准化，利用反射模式比较每个样品和标准白板之间的色差，总色差值（ΔE）计算如下：

其中，L、a、b为标准白板的颜色参数值，L*、a*、b*为不同凝胶糖果颜色参数值。

1.2.7 质构特性的测定 将室温（25 ℃）平衡30 min后的凝胶糖果切成圆柱体（直径1.5 cm，高1 cm），用TA.XT.plus 质构仪的探头（P50）测定其质构特性。测前、测中、测后速率分别为5.0、1.0、1.0 mm/s，连续两次下压，压缩形变比例为50%，触发力5 g。

1.2.8 水分分布的测定 参考Yan 等[19]的方法并加以改进，用低场核磁共振分析仪探究凝胶糖果的水分分布特性。磁场强度为0.5 T，频率为23.2 MHz。应用MultiExp Inv 分析软件得到Carr-Purcell-Meiom-Gill（CPMG）衰变曲线的横向自旋-自旋（T2）数据的指数分布拟合。

从自旋回波成像序列扫描凝胶样品的T1和T2质子密度图像。样品在100×100 mm 的视野下观察，分3 层进行分析，层厚、层间距和偏移量分别为2.0、1.0、15.2 mm，T1和T2的质子密度图像的重复时间和回波时间分别为TR=500 ms，TE=2.0 ms 和TR=1600 ms，TE=5.0 ms。

1.2.9 水分含量的测定 取2.5 g 凝胶糖果置于快速水分测定仪托盘内进行绝对水分含量的测定。

1.2.10 褪黑素保留率的测定 参考Kumar 等[20]的方法并加以改进，将每个凝胶样品（1 g）与5 mL 去离子水混合，并在研钵和研杵中研磨直至完全溶解。随后，将悬浮液以8000 r/min 离心10 min，分离出澄清的上清液用无水乙醇适当稀释，使用紫外可见分光光度计在278 nm 测得褪黑素的保留率。

1.2.11 感官评价 由10 位经过培训的人员（男女比例为1:1）组成评定小组对凝胶糖果外形、软硬度、弹性、黏牙性、咀嚼性、甜度进行评分，评定人员品尝不同组凝胶糖果之前要用矿泉水漱口，以免影响结果。单项评分范围为0～9 分，计算所有小组成员各项数据的平均值，评分标准如表1 所示。

表1 凝胶软糖的感官评分细则Table 1 Sensory grading rules of gummies

1.3 数据处理

所有试验平行测定三次，结果以平均值±标准差表示。实验数据采用IBM SPSS 统计软件进行方差和显著性分析，显著性水平P<0.05，使用Origin 2019软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 褪黑素纳米颗粒的特性及微观结构

采用反溶剂沉淀法制备了负载褪黑素的玉米醇溶蛋白/果胶复合纳米颗粒，通过扫描电镜对其微观结构进行观察，结果如图1 所示。颗粒具有较好的球形结构，粒径多数为150～200 nm，PDI<0.3，颗粒分布均匀，且褪黑素的包埋率为92.1%±0.93%。褪黑素纳米颗粒的形成主要是由于三种物质间形成了氢键和疏水力驱动，阴离子果胶的添加使颗粒之间的静电排斥力增强，提高了体系稳定性，有利于褪黑素在食品加工领域中的应用，Kumar 等[20]也利用纳米载体包埋甜菜红碱并用于凝胶糖果的制备，从而提高了甜菜红碱在应用过程中的稳定性和保留率。

图1 褪黑素纳米颗粒微观结构（A）及粒径分布（B）Fig.1 Microstructure (A) and particle size distribution (B) of nanoparticles loaded with melatonin

2.2 枸杞粉添加量对褪黑素-枸杞粉凝胶糖果特性的影响

食品颜色是食品品质的重要评价指标之一，对于食品的商品价值有重要影响[21]。枸杞子药食同源，味甘甜，色泽红而不艳，是天然的食源性着色剂。CIELab 颜色系统是目前色泽研究中应用较多的色彩系统[22]，由L*、a*、b*参数值共同确定一种颜色，其中L*值代表颜色的亮暗程度；a*值表示从绿色到红色的范围；b*值表示从蓝色到黄色的范围。不同枸杞粉添加量的凝胶糖果照片如图2A 所示，由于明胶的存在，未添加枸杞粉时凝胶糖果呈浅黄色，随着枸杞粉添加量的增大，凝胶糖果呈橘黄色。从表2 可以看出，随着枸杞粉添加量的增加，凝胶糖果的亮度显著减小（L*值从71.1 降至58.8，P<0.05），红度和黄度显著增加（a*值从-114.2 增至-110.5，b*值从20.9 增至50.6，P<0.05），这与图2A 的结果一致。由感官评价结果可知（图2B），枸杞粉添加量在0.4%时褪黑素凝胶糖果感官评分最高，酸甜风味最佳，在添加量高于0.4%后酸涩感越来越大，且色泽过深，综合考虑选择0.4%的枸杞粉添加量进行后续研究。

图2 枸杞粉添加量对凝胶糖果外观形态（A）和感官评价（B）的影响Fig.2 Effects of Lycium barbarum L. powder addition on the appearance (A) and sensory evaluation (B) of gummies

表2 枸杞粉添加量对凝胶糖果色差的影响Table 2 Effects of Lycium barbarum L. powder addition on color difference of gummies

2.3 明胶添加量对褪黑素-枸杞粉凝胶糖果特性的影响

近年来，质构分析作为一种快速、可量化的分析技术在食品工业中得到了广泛的应用，TPA 质构通过模拟人口腔对食品的咀嚼过程对食品质构进行感官评价，对样品进行二次压缩测试，获得质构特性参数[23]。不同明胶添加量对褪黑素纳米颗粒凝胶糖果质构特性的影响如图3 所示。结果表明，随着明胶添加量的增加，凝胶糖果的硬度（图3A）、胶着度（图3C）、咀嚼度（图3E）均具有显著提高（P<0.05），对其弹性（图3B）、黏聚性（图3D）和回复性（图3F）的影响均不显著（P>0.05）。卡拉胶对明胶质构特性的影响主要是因为卡拉胶与明胶分子间的交联作用，卡拉胶的加入使其带负电荷的硫酸盐基团与明胶中带正电荷的基团通过局部静电相互作用形成一定的网络结构[24]。随明胶添加量的增加，二者间的交互作用加强，分子间的联结程度增加，使凝胶网络结构更加致密，表现为硬度和胶着度的显著增强，而弹性凝胶体系自行恢复的能力有关[25]，变化不显著。

图3 明胶添加量对凝胶糖果质构特性的影响Fig.3 Effects of gelatin addition on texture properties of gummies

目前，低场核磁共振技术在研究食品干燥、贮藏、复水等过程中水分的状态与分布得到了广泛应用。即通过测定驰豫时间的变化解释样品中水分的分布状态和变化规律，具有快速、无损、有效等优点[26]。不同明胶添加量的凝胶糖果横向弛豫时间T2反演图如图4A 所示。凝胶糖果T2反演图有3 个峰，分别标记为T21、T22、T23。其中，如表3 所示，T21（0.40～0.46 ms）为强结合水，T22（5.72～10.19 ms）为弱结合水，T23（74.60～114.44 ms）为不易流动水，没有检测到自由水（T24）[27]。随着明胶添加量的增加，结合水（T21和T22）无明显迁移变化，但T23有明显差异（P<0.05），这部分水为不易流动水，对食品的品质和货架期有重要影响[28]。这说明混合体系中的结合水与明胶或卡拉胶基团结合紧密，受到的束缚力较大，弛豫速率大，弛豫时间较短[29]，在两种胶体的相互作用下，随着明胶添加量的增加，整个混合体系的分子间作用力增强，氢质子自由度降低，水分含量（图4B）从28.44%降至19.16%。同时，明胶添加量的变化对褪黑素的保留率（图4B）无显著影响（P>0.05），为92.0%～95.7%。经感官评价（图4C），当明胶添加量为18%时，制备的凝胶糖果软硬适中，弹性适宜，并具有良好的咀嚼口感，在添加量高于18%后，凝胶糖果的弹性、黏牙性和咀嚼性评分均降低，综合考虑选择18%的明胶添加量进行后续研究。

图4 明胶添加量对凝胶糖果弛豫时间、水分含量、褪黑素保留率、感官评价的影响Fig.4 Effects of gelatin addition on relaxation time,moisture content,retention efficiency of melatonin and sensory evaluation of gummies

表3 明胶添加量及烘干时间对凝胶糖果弛豫时间的影响Table 3 Effects of gelatin addition and drying time on relaxation time of gummies

2.4 烘干时间对褪黑素-枸杞粉凝胶糖果特性的影响

核磁共振成像通过显示样品内部质子密度的加权图像来反映氢质子的分布。通常情况下，水组分的变化是影响质子密度加权图像亮度的主要因素，样品中氢质子越多，质子密度图越亮，伪彩图越红[30]。不同烘干时间凝胶糖果的质子密度图像如图5B 所示，对比T1和T2加权图像，发现T1信号密度更亮、更蓝，说明所有样品均为结合水占主导地位。然而，不同烘干时间凝胶糖果的质子密度图像没有显著差异，相应的定量分析也显示信号强度没有显著差异（图5C，P>0.05）。

图5 烘干时间对凝胶糖果外观形态（A）和质子密度（B、C）的影响Fig.5 Effects of drying time on the appearance (A) and proton density (B,C) of gummies

图6 显示了不同烘干时间对褪黑素纳米颗粒凝胶糖果质构特性的影响。结果表明，随着烘干时间的增加，凝胶糖果的硬度（图6A）、胶着度（图6C）、咀嚼度（图6E）均显著增强（P<0.05），对弹性（图6B）、黏聚性（图6D）的影响均不显著（P>0.05），而回复性（图6F）显著减弱（P<0.05）。低温烘干不会导致明胶和卡拉胶的降解，从而保留其凝胶特性，烘干时间越长，水分含量越低，分子间作用力增强，主要表现为硬度增强，回复性减弱，颜色变深，体积变小（图5A）。

图6 烘干时间对凝胶糖果质构特性的影响Fig.6 Effects of drying time on texture properties of gummies

不同烘干时间的凝胶糖果横向弛豫时间T2反演图如图7A 所示。凝胶糖果T2反演图有3 个峰，分别标记为T21、T22、T23。其中，如表3 所示，T21（0.37～0.88 ms）为强结合水，T22（6.55～16.88 ms）为弱结合水，T23（69.96～184.75 ms）为不易流动水，没有检测到自由水（T24）。随着烘干时间的增加，T21和无明显迁移变化，T22和T23向结合水方向显著迁移（P<0.05），这说明结合水在混合体系中占主导地位，烘干时间越长，水分含量越低（图7B，从48.26%降至15.71%），有益于产品货架期的延长。同时，烘干时间的变化对褪黑素的保留率（图7B）无显著影响（P>0.05），为95.8%～97.7%。由感官评价结果表明（图7C），当烘干时间为12 h 和18 h 时，制备的凝胶糖果硬度适宜，均具有良好的咀嚼口感，但当烘干时间为18 h 时，其水分含量显著低于12 h（P<0.05），有利于凝胶糖果的长期贮藏，因此选定18 h 为最佳烘干时间。

图7 烘干时间对凝胶糖果弛豫时间、水分含量、褪黑素保留率、感官评价的影响Fig.7 Effects of drying time on relaxation time,moisture content,retention efficiency of melatonin and sensory evaluation of gummies

3 结论

通过本研究，可得出褪黑素凝胶糖果的最佳工艺配方：枸杞粉添加量0.4%，明胶添加量18%，卡拉胶添加量5%，山梨糖醇添加量17.5%，麦芽糖醇添加量17.5%，烘干时间为18 h，研制的褪黑素凝胶糖果色泽均匀有光泽，口感适宜，且褪黑素保留率高于92%。凝胶添加量会显著影响凝胶糖果的硬度、胶着度和黏聚性。适宜的烘干时间不仅显著影响凝胶糖果的回复性，还能有效降低其水分含量。本研究为褪黑素纳米颗粒凝胶类食品的研制提供新思路，拓展了褪黑素等功能因子在食品领域的开发利用途径。