蛋白质组学和代谢组学技术在蜂产品中的应用研究进展

林聪聪，赵 妍，刘 睿，鲁 群,

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070；2.武汉市蜂产品质量控制工程技术研究中心，湖北武汉 430070）

蜂产品指的是蜜蜂在生殖繁衍过程中形成的有用物质，包括蜜蜂的采集物、分泌物和生殖繁衍物[1]。蜜蜂的采集物包括蜂蜜、蜂花粉和蜂胶，蜜蜂的分泌物包括蜂毒、蜂王浆、蜂蜡，蜜蜂自身生殖繁衍物包括蜂蛹和蜂王幼虫。蜂产品具有丰富的营养成分，如糖类、蛋白质和氨基酸、有机酸、维生素和多酚类物质。此外，蜂产品具有多种生物活性，如抗菌、抗氧化、抗炎、保护肠道、调节机体免疫和神经系统等[2-3]。近年来随着人们越来越重视健康，蜂产品作为优质的营养补充品，其消费量显著增加，其中蜂蜜的年消费量能达到30 万吨[4]。在巨大的商业利益面前，不法商家通过以次充好、混淆蜂产品的地理源和植物源等掺假造假的方式牟利，这些行为严重损害了消费者的利益[5]。蜂产品的成分极其复杂，还受到地理环境、蜜源植物、蜂种等多种因素的影响，并且市面上的蜂产品掺假造假手段层出不穷，导致蜂产品的鉴别和鉴伪难度不断加大。单一的理化检测技术和传统的仪器分析技术只能检测蜂产品中的一类或几类成分，不能对蜂产品的成分进行全面、整体的分析，难以解决蜂产品掺假造假的问题。在蜂产品的生物活性研究方面，虽然蜂产品已被证明具有多种生物活性，但其生物活性的机制还需要进一步深入阐明。

组学技术是近几十年来发展起来的新学科，主要基于高通量测序、凝胶电泳、质谱、核磁共振技术对成千上万的DNA、RNA、蛋白质、代谢小分子等物质进行研究和分析[6]。组学技术具有高通量、高分辨率、灵敏度高、特异性强等特点[7]，能够实现待测物成分的多目标、全组分的同时鉴定，特别是传统检测技术难以检测到的微量成分。组学技术不仅可以用于蜂产品的成分鉴定，还能通过挖掘其中的特征标志物实现蜂产品的鉴别和鉴伪，此外，组学技术还能系统深入地阐明蜂产品中活性成分的生物活性机制，在蜂产品研究过程中发挥着越来越重要的作用。近年来，组学技术中的蛋白质组学和代谢组学技术用于蜂产品领域的研究明显增多，本文综述了蛋白质组学和代谢组学技术在蜂产品成分鉴定、鉴别和鉴伪、生物活性机制研究中的应用，以期为组学技术在蜂产品研究中的进一步发展提供参考。

1 蛋白质组学技术在蜂产品研究中的应用

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，分析其结构、性质与功能、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间相互作用，并在整体水平上研究蛋白质调控规律[8]。蛋白质组学研究策略分为“自下而上”和“自上而下”型，其中“自下而上”型是在多肽水平上对蛋白质进行分析研究；而“自上而下”型是从复杂样品中分离出完整蛋白质，再用质谱进行分析（图1）。蛋白质定量常用非标记定量技术和标记定量技术[9]，前者成本较低，后者准确度更高。

图1 “自下而上”和“自上而下”型蛋白质组学研究途径Fig.1 "Bottom-up" and "top-down" approaches to proteomics

1.1 蛋白质组学在蜂产品成分鉴定中的应用

蜂产品中含有多种蛋白质，特别是蜂毒、蜂王浆和蜂花粉中蛋白质的含量和种类丰富，其中仍有很多蛋白质未被鉴定。在蛋白质组学出现前，传统的蛋白质鉴定方法包括蛋白质微量测序和氨基酸组成分析等，但是这些方法灵敏度较差、低通量且耗时费力，鉴定出的蛋白质有限，而蛋白质组学依托高分辨质谱，具有高通量和高灵敏度的优势。蛋白质组学技术在蜂产品研究中的应用见表1。早在2005 年就有研究人员用蛋白质组学的方法对蜂毒中的蛋白质进行研究，鉴定出了Api m6、Api m2 和Api m1 等6 种过敏原以及3 种新的蜂毒蛋白，但是由于技术限制，一些小分子量的蛋白质因低于设备检出限而未被检出[10]。随着蛋白质组学技术的不断改进和先进检测设备的出现，通过纳米液相色谱串联质谱分析法可以鉴定出蜂毒中33 种蛋白质，包括4 种新的蜂毒蛋白[11]。Resende 等[12]鉴定了非洲化意大利蜜蜂和另外两个意大利蜜蜂亚种蜂毒的蛋白质组成，发现检出的51个蛋白质中，共有的蛋白质为42 个。此外，基质辅助激光解吸结合电喷雾电离可以检测到蜂毒中269种蛋白质和多肽，通过傅里叶变换离子回旋共振质谱发现了102 种蛋白质和多肽，且其中的83 种以前从未在蜂毒样本中被分析过，这些研究扩宽了人们对蜂毒成分的认识[13-14]。蜂王浆主蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）占蜂王浆总蛋白质的80%以上，主要包括MRJP1～MRJP9[15]，此外蜂王浆中还有其它蛋白质。通过基于凝胶和无凝胶技术对意大利蜜蜂所产的蜂王浆进行蛋白质组学研究，发现了19 个新蛋白质，这些新蛋白质与蛋白质生物合成、碳水化合物代谢和氧化还原过程相关[16]。蜂花粉中也含有丰富的蛋白质，运用蛋白质组学可以更全面分析其蛋白质组成，有研究报道采用蛋白质组学从蜂花粉中鉴定出195 个多肽，并从中筛选出具有抗血管紧张素转化酶活性的多肽[17-18]。此外，蛋白质组学技术还鉴定出蜂花粉中7 种蛋白质是潜在的过敏原[19-20]。

1.2 蛋白质组学在蜂产品鉴别和鉴伪中的应用

利用蛋白质组学筛选出蜂产品中的特征标志性蛋白或多肽，不仅可以用于蜂产品的品质评价，还可用于蜂产品的昆虫源、植物源鉴别，帮助解决蜂产品的掺假造假问题。蜂王浆的质量容易受到储存条件的影响，研究发现，在室温下保存1 年的蜂王浆，其中的MRJP4、MRJP5 和葡萄糖氧化酶等会明显减少，应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法研究MRJPs 在不同条件下储藏6 个月的变化，结果表明MRJP5 可以作为蜂王浆产品新鲜度的标记物[21-22]。此外，也有研究表明MRJP4 对温度更为敏感，可以作为蜂王浆新鲜度的标志物[23]。中华蜜蜂和意大利蜜蜂产的蜂王浆中的MRJP2 和MRJP3 在分子量和等电点上存在显著差异，可以用于蜂王浆的昆虫源鉴别[24]。此外，蜂王浆的蛋白质组成也可以用于植物源的鉴别，研究表明MRJP5 和9 种低丰度蛋白对蜂王浆植物源的区分有显著贡献[25]。通过凝胶蛋白质组学技术对枇杷蜜和油菜蜜等不同植物源蜂蜜的蛋白质进行分析，发现几丁质酶的酶谱分析可以用于鉴定蜂蜜植物源[26]。世界著名的麦卢卡蜂蜜因具有显著的抗菌、促进伤口愈合、改善口腔及胃肠道健康等功能，被批准为医用级蜂蜜，由于其价格高昂，所以市场上常有麦卢卡蜂蜜造假的现象[27]。Bong 课题组采用“自上而下”的蛋白质组学方法，利用高分辨质谱鉴定了麦卢卡蜂蜜中50 种昆虫源蛋白质以及17 种植物源蛋白质，从中筛选出12 种多肽作为潜在的标志物，建立了一种麦卢卡蜂蜜真假鉴别的方法[28]。此外，也有研究通过定量MRJPs 并筛选特异性肽段来验证蜂蜜的真实性[29]。

1.3 蛋白质组学在蜂产品生物活性机制研究中的应用

蛋白质是一切生命活动的直接承担者和表现者，也是药物治疗的作用靶点。蛋白质组学可以了解疾病发生机制、寻找治疗靶点和解释功能蛋白的生物活性作用途径。蜂产品富含多种生物活性成分，但是发挥活性的机制暂未充分阐明，蛋白质组学可以用于明确其生物活性机制。通过蜂毒干预关节炎小鼠模型的蛋白质组学研究，揭示了蜂毒发挥抗类风湿性关节炎的作用机理[30]。将功能蛋白质组学应用在蜂王浆生物活性研究中，揭示出MRJP1 与抗高血压活性相关[31]，MRJP2 的次要同系物apalbumin2a 与抗菌活性相关[32]。10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）是仅存在于蜂王浆中的一种不饱和羟基脂肪酸，可以保护细胞和组织，蛋白质组学技术揭示了10-HDA 通过上调被·OH 抑制的广谱蛋白而保护血管平滑肌细胞，因而具有维护血管健康的潜力[33]。Erban 等[34]对13 种不同植物源蜂蜜的蛋白质组进行了分析，挖掘出蜂蜜中具有抗菌特性的潜在蛋白质，如防御素-1、丝氨酸蛋白酶抑制剂等。采用二维凝胶电泳与液相色谱质谱联用相结合的方式对麦卢卡蜂蜜处理过的金黄色葡萄球菌进行研究，发现麦卢卡蜂蜜会引起细菌的DLD、EF-Tu、UspA蛋白下调，CspC 蛋白上调，揭示了麦卢卡蜂蜜对金黄色葡萄球菌的抑制作用机制[35-36]。Tualang 蜂蜜的抗癌作用被广泛报道，Amran 等[37]用Tualang 蜂蜜对非小细胞肺癌细胞系的H23 和A549 细胞进行干预，通过蛋白质组学技术发现该蜂蜜能调节与非小细胞肺癌发展相关的信号通路的关键蛋白，且ELAVL1、H3F3A 和PCNA 可能是作用靶点。在蜂胶中，蛋白质组学证明了其诱导细胞凋亡的机制与调控GRP78、PRDX2、LDHB 等蛋白质有关[38]。

2 代谢组学技术在蜂产品研究中的应用

代谢组学是对某一生物或细胞在某一特定生理时期内所有小分子代谢产物进行分析的一门学科。近年来，代谢组学的检测方法和分析思路被广泛用于食品和农产品研究领域，通过分析食品和农产品中的小分子物质来进行溯源和品质评价。代谢组学按研究目的可以分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学。靶向代谢组学具有偏向性，仅对某个或一类目标代谢物进行定性定量分析，而非靶向代谢组学则具有无偏向性，其目的是最大限度覆盖代谢物，无偏向性地对所有代谢小分子进行检测分析[39]。代谢组学一般分析流程包括实验设计、样本采集与处理、数据采集、数据处理、统计发现、定性鉴定、通路分析及生物学阐释（图2）。目前常用的数据库包括HMDB、KEGG、Mass Bank 和NIST 等，在代谢物鉴定过程中，可以结合多个数据库进行分析，以便代谢物信息更全面、准确。

图2 代谢组学分析流程Fig.2 Metabolomics analysis workflow

2.1 代谢组学在蜂产品成分鉴定中的应用

蜂产品的化学成分复杂，除了蛋白质等大分子物质，还含有氨基酸、多酚、有机酸、维生素等小分子物质。蜂产品中的小分子物质不仅种类繁多，并且有很多微量成分。传统的检测技术难以实现蜂产品中多成分的全面鉴别，而代谢组学具有高通量、高灵敏度等优势，能够实现蜂产品中多目标、全组分的高通量同时鉴别，特别是传统检测技术无法检测到的微量成分。张丽翠等[40]对蜂王浆的代谢组学分析条件进行了优化，通过比较分析不同溶剂提取的蜂王浆代谢物，发现80%甲醇或80%乙醇是最佳的提取溶剂，并证明反相液相色谱和亲水作用色谱分别联合高分辨质谱可以较全面地检测蜂王浆中的小分子化合物。通过代谢组学分析蜂王浆中的代谢物，发现其中的77 个小分子代谢物及其丰度随蜂王浆产量和收获时间的增加而变化，可用于蜂王浆的收获时间评估和品质评价[41]。代谢组学在蜂毒和蜂花粉成分鉴定研究中的应用还处于初步阶段，最近一项研究通过非靶向代谢组学技术较全面地鉴定了蜂毒中的214 个代谢物，并通过靶向代谢组学技术定量了138 个代谢物，证实了蜂毒中氨基酸、碳水化合物和有机酸的存在，还提供了以前研究中未报到的核苷、核苷酸、嘌呤衍生物的信息[42]。通过非靶向代谢组学技术对不同品种蜂花粉中的467 种多酚进行注释，可以发现黄酮类物质是其含量最多的化合物，其次是酚酸、木脂素等[43]。发酵蜂花粉也是近年来蜂产品领域的研究热点，通过广靶代谢组学发现经过发酵后蜂花粉中的氨基酸、多不饱和脂肪酸、有机酸和酚酸等成分的含量显著升高，表明发酵能提高蜂花粉的营养价值[44]。

2.2 代谢组学在蜂产品鉴别和鉴伪中的应用

蜂产品的化学成分受到昆虫源、植物源、地理源等因素的影响，不同来源的蜂产品的化学成分、品质、生物活性存在差异，因此需要对蜂产品的昆虫源、植物源、地理源进行鉴别。代谢组学依托高精度的现代分析仪器，能够获得庞大的数据量，再通过多元统计分析对数据进行处理和提取，可以实现特征标志物的筛选和鉴定，而特征标志物可用于蜂产品的昆虫源、植物源、地理源鉴别。

通过非靶向代谢组学技术分析意大利蜜蜂产的蜂蜜和中华蜜蜂产的蜂蜜，从141 个代谢物中筛选出3 个化合物作为中华蜜蜂所产蜂蜜的标志物，可用于区分中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，实现了蜂蜜的昆虫源鉴别[45]。此外，代谢组学技术用于意大利蜂蜜的研究结果表明内源性双甘油醚可以作为意蜂蜂蜜的关键标志物[46]。

目前，代谢组学在蜂蜜的植物源鉴别中应用最多。利用基于超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱的代谢组学分析单花蜂蜜，发现羟基红花黄色素A 可以作为新疆特色红花蜂蜜的特征标志物[47]，水苏碱可以作为米团花蜂蜜的特征标记物[48]。利用基于超高效液相色谱串联四级杆静电场轨道阱质谱的代谢组学对中国不同地区不同植物源蜂蜜进行研究，发现香叶醛和脱落醛可以作为荔枝蜜的标记物，刺桐碱可以作为金合欢蜜的标志物，异樱花素可以作为辽宁和陕西金合欢蜜的标志物[49]。利用基于核磁共振的代谢组学技术可以区分芬兰不同植物源的蜂蜜，并筛选出2-羟基-3-甲基丁酸、2-羟基-3-甲基戊酸等可以作为蒲公英蜜的特征标记物[50]。此外，代谢组学也开始被用于蜂胶和蜂花粉的植物源鉴别。研究发现苯丙烷衍生物、类黄酮、高良姜素和白杨素等特征标志物可用于蜂胶植物源的鉴别[51]，蜂花粉中的花青素、咖啡酸等35 种酚类化合物可以用于蜂花粉的植物源鉴别[43]。

代谢组学还被用于蜂蜜的地理源鉴别中，通过基于核磁共振的代谢组学技术筛选出白杨素、松属素、短叶松素、脱落酸和山姜酮可以作为欧洲不同地区金合欢蜜的标志物，并且利用这些标志物对欧洲金合欢蜜的地理源鉴别准确率可以达到100%[52]。蜂胶的化学组成受地理源的影响较大，有研究表明白杨素、高良姜素和芹菜素等化合物可以作为区分中国不同气候地区蜂胶的标志物[53]，高良姜素、白杨素、木犀草素等标志物可以实现中国蜂胶和希腊蜂胶的产地鉴别[54]。基于核磁共振的代谢组学技术也可以用于追溯蜂王浆产品的地理源[55]。

蜂产品中最容易出现掺假造假问题的是蜂蜜。蜂蜜的掺假造假方式主要分为两类，一类是添加糖浆，一类是以次充好，包括以低劣蜂蜜冒充高品质蜂蜜、以加热浓缩蜜冒充成熟蜂蜜等。利用基于核磁共振的代谢组学技术可以区分无刺蜂蜂蜜和添加C3、C4 糖浆的掺假蜂蜜[56]，利用代谢组学方法在人工加热浓缩的金合欢蜜中检测出N-（1-脱氧-1-果糖）苯丙氨酸，它是美拉德反应初始阶段形成的产物，常见于热加工处理中，该化合物可以用于区分金合欢蜜是天然成熟还是人工加热浓缩而成[57]。

2.3 代谢组学在蜂产品生物活性机制研究中的应用

蜂产品具有多种生物活性，通过收集体内实验或体外实验的代谢物并进行代谢组学分析，可以用于阐明蜂产品的生物活性机制。代谢组学技术在蜂产品研究中的应用见表2。Mustafa 等[58]通过基于核磁共振的代谢组学结合逆转录聚合酶链反应发现无刺蜂蜂蜜中的苯丙氨酸通过上调脑源性神经营养因子基因而改善小鼠的空间记忆能力。结合代谢组学技术和生物活性评价，可以发现埃及和巴西不同地区蜂胶的酚类物质与抗氧化活性之间存在着很强的相关性，且香豆酰乙酰甘油、高良姜素、棕榈酸等可以作为抗氧化和黄嘌呤氧化酶抑制活性的标志物[59-60]。蜂胶还具有抗菌活性，利用代谢组学揭示了蜂胶对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用机制[61]，阐明了蜂胶通过提高能量代谢和破坏氧化还原稳态而起到抗结核分歧杆菌的作用[62]。此外，还有代谢组学研究结果表明蜂胶提取物具有抗癌作用[63]以及减轻D-半乳糖诱导的小鼠骨骼肌衰老作用[64]。蜂王浆的主要成分MRJPs 可以缓解非酒精性脂肪肝疾病，广靶代谢组学揭示了MRJPs 通过调节α-亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸和其它不饱和脂肪酸的生物合成来调控脂质代谢、氧化应激和炎症，实现对非酒精性脂肪肝疾病的介导[65]。MRJPs 还可以通过半胱氨酸和牛磺酸代谢及能量代谢途径改善老年大鼠的空间记忆能力，具有预防认知障碍的潜力[66]。此外，还有研究表明蜂王浆中的功能活性成分10-HDA可以通过上调2 型糖尿病小鼠肝脏中PI3K/AKT/GSK3β 信号通路来提高胰岛素敏感性，促进糖原合成，为蜂王浆应用于糖尿病治疗提供理论支持[67]。代谢组学用于蜂毒和蜂花粉生物活性的研究也有少量报道。已有研究表明蜂毒可以引起与三羧酸循环及脂代谢有关的标志物回调，从而对类风湿性关节炎起到良好的治疗效果[68]。蜂花粉中丰富的酚类物质使其具有良好的抗炎[69]、抗癌细胞增殖[70]及肠屏障保护作用[71]。通过非靶代谢组学技术结合活性相关性分析，揭示了蜂花粉中的酚胺类化合物是蜂花粉抑制酪氨酸酶活性的主要成分[72]。

表2 代谢组学技术在蜂产品研究中的应用Table 2 Application of metabolomics technology in bee products research

3 结语与展望

随着组学技术的不断发展和完善，蛋白质组学和代谢组学技术已在蜂产品成分鉴定、鉴别和鉴伪、生物活性机制等研究中发挥了重要作用。但仍然存在一些问题需要解决：蛋白质组学存在着大样本量无法快速精准定量的问题；基于核磁共振技术的代谢组学分析存在灵敏度低的问题，而基于质谱的代谢组学对于不同种类的代谢物需要不同的色谱分离、样品前处理较复杂；在化合物鉴定过程中，不论是代谢组学还是蛋白质组学都存在数据库不完善的问题，需要比对多个数据库进行鉴定。此外，其他组学技术在蜂产品研究中的应用还相对较少，并且单一的组学技术仅能在某一个层面反应生物信息，今后应将多组学联合技术运用到蜂产品研究中。多组学技术伴随仪器的先进智能化和数据整合分析技术的发展而出现，它能有机整合多种组学技术获得的多维信息[73]。在蜂产品的成分鉴定、鉴别和鉴伪方面，可以采用蛋白质组学、代谢组学、脂质组学的多组学联合技术，能够更加全面地覆盖蜂产品中的化学成分；在蜂产品的生物活性机制研究中，可以采用基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学联合技术，能够更加全面了解基因调控和代谢因果关系、更加系统阐明生物功能和生理机制。