黑曲霉固态发酵对金银花多酚类物质释放及增效作用

王懿文，谢纯良，朱作华，周映君，龚文兵，饶力群，彭国平，李双祁，颜少慰，彭源德*，汪启明*

（1.湖南农业大学生命与科学技术学院道地药用植物规范化栽培与综合利用湖南省工程实验室，湖南 长沙 410128；2.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410128；3.湖南菲勒生物科技有限公司，湖南 长沙 410128；4.水羊集团股份有限公司，湖南 长沙 410128）

金银花（Lonicera japonica），学名忍冬，为忍冬科忍冬属多年生半常绿缠绕灌木，其初开花蕾或花苞为药用部位，是我国的传统药食同源中药材。在食品开发上，有较广阔的应用前景，同时市场需求量大，具有较高经济价值。此外，早在公元589 年南北朝《名医别录》中就记载，金银花具有抗氧化、抗病毒、抑菌、消炎镇痛、降血糖等功效[1-4]。而这些作用主要是由于金银花中富含多种活性物质，如多酚类、黄酮类、皂苷类、有机酸类、萜类、环烯醚萜类、挥发油等[5-6]。但是金银花中的这些物质多以结合态形式结合在细胞壁、木质素等结构上，导致现行主流的活性物质提取方法，如浸提法、醇提法、酶辅助提取法等，无法有效地提取出这些活性物质，降低了金银花的生物利用度和可及性。

微生物对其发酵基质有较强的生物转化能力，利用微生物发酵处理中药材相较于传统的中药熬制手法具有条件温和、转化率高、后处理简单等优点[7-9]，此外，还能降低毒性[10]，或是通过产生新的代谢物达到增加疗效的效果[11-12]。目前，关于金银花发酵多集中于液体发酵，对于固体发酵研究较少。两者相比较，固态发酵在生产工艺上更为简单，省去了部分预处理、回收纯化等步骤，整个生产过程中没有废水、废气产生，属于低投资、耗能低且高产的一种发酵方式[13]。此外，在固体发酵中，菌丝和物料缠结，在发酵体系中易于产生发酵温度和产物浓度梯度，从而使得霉菌在逆环境下产出更多胞外酶和更多次级代谢产物[14]。

黑曲霉（Aspergillus niger）属丝孢目丛梗孢科曲霉属，是丛梗孢科中的一个常见种。作为美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）准许使用的工业酶类生产菌之一，具有发酵周期短、产酶量大、不产毒素等优点[15]。因所产酶系丰富，使其成为工业微生物中常见的菌种之一，这一特性也使得黑曲霉能够有效地分解金银花中的纤维素、果胶、木质素等物质，相较于液体发酵能够促进物质的释放，提高发酵效率，从而降低能耗提高产量[16]。已有研究表明黑曲霉产酶机制为诱导表达机制，即黑曲霉通过识别不同的基质，进行诱导表达形成不同的酶系[17]。利用不同的基质对黑曲霉进行培养，产出更优、更高比例的酶系成为目前黑曲霉的研究热点。因此，本文通过黑曲霉固态发酵金银花，以期为金银花深加工产品提供一定理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花干花：湖南龙回一都富硒茶业股份有限公司；黑曲霉曲精：济宁玉园生物科技有限公司；芦丁、焦性没食子酸、水杨酸、2，2＇-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；Na2CO2、NaNO2、Al（NO2）3、NaOH、H2O2（均为分析纯）：湖南汇虹试剂有限公司；福林酚（分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；甲醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硫酸亚铁、过二硫酸钾、铁氰化钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验设备与仪器

超声波清洗机（JP-060S）：深圳市洁盟清洗设备有限公司；酶标仪（I510）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；高速离心机（3K15）：美国Sigma 公司；电子天平（LQ-C3002）：上海瑶新电子科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑曲霉孢子菌悬液制备

将黑曲霉孢子菌粉接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA） 培养基上，30 ℃恒温培养7～9 d，刮取长势良好的菌孢子加入到100 mL 无菌水中，120 r/min 振荡30 min，备用。

1.3.2 金银花固体发酵及样品制备

金银花粉碎成0.1～0.3 cm 小段，121 ℃灭菌30 min。称取3 g 灭菌的金银花粉末，加入5 mL 无菌水（含水量约50%），再接入2 mL 黑曲霉孢子菌悬液，混匀后置于培养箱30 ℃培养，分别于3、6、9 d 取样，空白组加入等量无菌水，同样条件存放、取样。将取得的样品喷洒70%酒精杀菌，冷冻干燥，研磨粉碎。提取方法参照曹晓琴等[18]的方法并略加修改，称取1 g 冷冻干燥粉末，加入10 mL 70%乙醇，于50 ℃、300 W 条件下超声30 min，重复2 次，合并滤液，于4 ℃保藏。

1.3.3 总多酚含量测定

多酚含量测定参考福林酚比色法[19]并加以修改。以芦丁为标品，标品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出标准曲线回归方程：Y=1.295 4X-0.002 7（R2=0.999）。向10 mL EP 管中加入50 μL 待测样品，纯水定容至1 mL，依次加入1.5 mL 福林酚，混匀后反应3～8 min，加入1 mL 20% Na2CO3，用纯水定容至10 mL，混匀后反应1 h，于波长760 nm 处测定吸光度，代入标准曲线中求得样品中的多酚含量。

1.3.4 总黄酮含量测定

黄酮含量测定参考AlCl3比色法进行[20]，并加以修改。以没食子酸为标品，标品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出标准曲线回归方程：Y=0.004 6X+0.102 4（R2=0.995）。向50 mL EP 管中加入1 mL 待测样品，纯水定容至5mL，依次加入1mL5%NaNO2，混匀，6min 后加入1mL10%Al（NO3）3，混匀，6min 后加入10mL4%NaOH，纯水定容至25 mL，混匀，反应15 min，于波长510 nm 处测定吸光度，代入标准曲线中求得样品中的黄酮含量。

1.3.5 总皂苷含量测定

试验方法参考徐芳菲等[21]的方法，并加以修改。以齐墩果酸为标品，标品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出标准曲线回归方程：Y=0.006X+0.096 4（R2=0.998）。吸取100 μL 样品，40 ℃烘箱内挥干溶剂，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸和0.6 mL 高氯酸密封后，65 ℃恒温水浴20 min，立即冰水浴降至室温，加入5 mL 冰醋酸，摇匀，于550 nm 波长处测定吸光度，再根据标准曲线计算总皂苷含量。

1.3.6 抗氧化活性测定

1.3.6.1 DPPH 自由基清除率的测定

参考文献[22]的方法，在2 mL EP 管中加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH 和1 mL 待测样液，用等量无水乙醇替换DPPH 作对照组；用等量无水乙醇替换待测样液作空白组，混匀，避光反应30 min。吸取200 μL 反应液于波长517 nm 处测定吸光度。根据式（1）计算DPPH自由基清除率（R1，%）。

式中：A、B、C 分别为试验组、对照组、空白组的吸光度。

1.3.6.2 羟自由基清除率的测定

参考文献[23]的方法，加入6 mmol/L FeSO4、待测样液、6 mmol/L H2O2各2 mL 于10 mL EP 管中，用等量的纯水替换待测样液作对照组，混匀静置10 min；加入2 mL 6 mmol/L 水杨酸溶液，混匀反应30 min。吸取200 μL 反应液于波长510 nm 处测定吸光度。根据式（2）计算羟自由基清除率（R2，%）。

式中：A、B 分别为试验组、对照组的吸光度。

1.3.6.3 ABTS 阳离子自由基清除率的测定

参考文献[24] 的方法，取7.4 mmol/L ABTS 和2.6 mmol/L K2S2O8各25 mL 混合，室温下避光静置12 h。用95%乙醇将混合液稀释至其在735 nm 处的吸光度为0.68～0.72。吸取0.2 mL 样液于2 mL EP 管中，用95%乙醇替换待测样液作空白组，用稀释后试剂定容至1 mL，静置反应6 min。吸取200 μL 反应液于波长734 nm 处测定吸光度。根据式（3）计算ABTS 阳离子自由基清除率（R3，%）。

式中：A、B 分别为试验组、对照组的吸光度。

1.3.6.4 总还原力的测定

参考文献[25]的方法，取1 mL 待测样液于10 mL EP 管中，等比例加入0.2 mol/L 磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）和2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液共5 mL，水浴锅50 ℃恒温反应20 min，加入2.5 mL 10% C2HCl3O2溶液。分别吸取上清液和纯水等比例混匀至5 mL，加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，反应10 min后于波长700 nm 处测定吸光度，样品总还原力与OD值呈正相关性。

1.3.7 透明质酸酶抑制活性测定

试验方法参考Bralley 等[26]的方法，并加以修改。在10 mL EP 管中等比例滴加待测样品和透明质酸酶液共1 mL，水浴锅37 ℃孵育20 min；加入0.1 mL CaCl2溶液，继续孵育20 min；加入0.5 mL 透明质酸钠液，37 ℃反应40 min；立即转置常温冷却5 min，等比例加入NaOH 溶液和乙酰丙酮溶液共1 mL，沸水浴反应15 min 后，立刻冰浴5 min，转置常温10 min；加入0.5 mL纯水和1 mL 埃尔利希试剂，混匀反应30 min，于波长530 nm 处测定其吸光度，根据式（4）计算透明质酸酶抑制率（R4，%）。

式中：A 为对照空白组（水代替样品溶液，醋酸代替酶液、透明质酸钠溶液）吸光度；B 为对照组（水代替样品）吸光度；C 为试验空白组吸光度（醋酸溶液代替酶液、透明质酸酶）；D 为试验组吸光度。

1.3.8 发酵过程中酶活测定

1.3.8.1 粗酶液提取

取固体发酵的金银花，按料液比1∶20（g/mL）加入0.1 mol/L（pH4.5）柠檬酸缓冲溶液，于摇床30 ℃、160 r/min 振荡6 h，8 000 r/min 离心5 min，收集上清液，即得酶提取液。酶活测定方法参考田杰[27]、Xue 等[28]的方法，并加以修改。

1.3.8.2 纤维素酶酶活测定

吸取250 μL 样品，50 ℃水浴预热5 min，随后试验组加入50 ℃预热的1%羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC）溶液250 μL，空白组不加入酶液，50 ℃反应15 min，随后加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，空白组补足250 μL 底物，沸水浴5 min，于540 nm 处测定吸光度，代入标准曲线中求得样品中的纤维素酶酶活。

1.3.8.3 木聚糖酶酶活测定

吸取250 μL 样品，50 ℃水浴预热5 min，随后试验组加入50 ℃预热的1%木聚糖250 μL，空白组不加入酶液，50 ℃反应15 min，随后加入1.5 mL DNS 溶液，空白组补足250 μL 底物，沸水浴5 min，于540 nm 处测定吸光度，代入标准曲线中求得样品中的木聚糖酶酶活。

1.3.8.4 β-葡萄糖苷酶酶活测定

吸取30 ℃预热的样品1 mL，加入30 ℃预热的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-Dglucopyranoside，PNPG）1.5 mL，空白组不添加，于30 ℃反应30 min，加入2.5 mL 0.5 mol/mL Na2CO3，空白组再补齐1.5 mL PNPG，于420 nm 处测定吸光度，代入标准曲线中求得样品中的β-葡萄糖苷酶酶活。

1.4 数据处理

数据结果以平均值±标准差表示。统计学比较采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey 检验，利用Pearson 系数进行进行相关分析，P＜0.05 和P＜0.01 表示有统计学意义。所有图表绘制及数据分析采用Graphpad Prism 9.4 版软件进行。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉固态发酵金银花活性物质含量变化

《中国药典》（2020 版）以绿原酸（酚酸类）和木犀草素（黄酮类）含量判断金银花品质，此外金银花中的药效物质以多酚、皂苷、挥发油等为主[5]。黑曲霉固态发酵金银花活性物质含量结果见图1。

由图1 可知，金银花经过黑曲霉固体发酵后，总多酚、总黄酮和总皂苷含量都有明显提高。持续发酵6 d，其中总多酚和总黄酮分别由76.60 mg/g 和20.76 mg/g升高至97.56 mg/g 和24.12 mg/g，继续发酵至9 d 略微下降至95.09 mg/g 和23.65 mg/g；总皂苷含量由3.50 mg/g 持续升高至4.39 mg/g。杨丹等[29]利用黑曲霉发酵陈皮，发现其黄酮物质含量和抗氧化能力均有显著提高。阎欲晓等[30]利用黑曲霉对甘蔗叶进行发酵，黄酮和多酚含量分别提高135%和92%，且提升率与纤维素酶和β-葡萄糖苷酶酶活成正比，同时DPPH·、·OH清除率得到显著提高。当发酵至6 d 时，多酚含量变化趋于稳定，甚至出现下降，原因可能为基质中有效碳源被耗尽，黑曲霉代谢速率减缓，甚至开始利用多酚类活性物质作为碳源，致使多酚类物质含量开始下降，结合大面积生产时的能耗问题，可选定6 d 为最佳发酵时间。

2.2 黑曲霉固态发酵金银花抗氧化能力变化

DPPH 为一种稳定的氮中心自由基，由于其能够接受一个电子或氢离子从而从紫色褪色为黄色或者无色，因此常被用于对供氢能力的检测[22]；ABTS+·清除率可以评估样品的抗氧能力和自由基产生能[31]。·OH可能是干旱胁迫下大部分氧化损伤的主要原因[23]。黑曲霉固态发酵金银花抗氧化能力变化见图2。

图2 黑曲霉固态发酵金银花抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由图2 可知，金银花经过发酵后，抗氧化能力得到明显提高。发酵0～6 d，ABTS+·清除率、·OH 清除率分别由32.09%和23.43%提升至55.06%、30.10%，且发酵至6 d 后，保持稳定不变。发酵0～9 d，DPPH·清除率由61.25%稳定提升至84.57%，总还原力由0.730 9 提升至0.818 9。冯军伟等[32]利用黑曲霉对脱脂麦胚进行发酵，其DPPH·、·OH 清除率在发酵至82 h 提升至最高值，分别为75.68%、80.40%。袁明贵等[33]利用黑曲霉对凉茶渣进行发酵，发酵后DPPH·、·OH 清除率分别提高至87.36%、95.63%。结果表明抗氧化功效的变化与多酚等活性物质变化呈正相关，这与多酚功效的相关报道相符合[34]。

2.3 黑曲霉固态发酵金银花抗过敏能力变化

透明质酸酶是I 型过敏反应的重要介导酶，研究表明透明质酸酶活性会受到各种肥大细胞释放组胺的药物修饰，一些抗敏药物对透明质酸酶有较强的抑制活性，因此透明质酸酶活性抑制率可作为研究抗过敏作用的指标。黑曲霉固态发酵金银花抗过敏能力结果见图3。

图3 黑曲霉固态发酵金银花抗过敏能力Fig.3 Antiallergic ability of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由图3 可知，金银花经过黑曲霉固体发酵后，其抗过敏能力有明显提高。发酵0～3 d，透明质酸酶抑制率由13.51%迅速升高至54.05%；在3～6 d，透明质酸酶抑制率提升较为缓慢，提升至64.86%；发酵至9 d 透明质酸酶抑制率迅速增至98.64%。

2.4 黑曲霉固态发酵金银花产酶酶活结果分析

黑曲霉的产酶机制为底物诱导性机制，即通过识别发酵基质产出不同酶活的酶系。黑曲霉固态发酵金银花产酶酶活测定结果见图4。

图4 黑曲霉固态发酵金银花产酶酶活Fig.4 Enzyme activity of L.japonica during solid-state fermentation by A.niger

由图4 可知，黑曲霉以金银花为基质，发酵过程中持续产纤维素酶、β-葡萄糖苷酶至酶活达11.70、15.78IU/g；木聚糖酶发酵至6 d 时酶活达到最高，为32.39 IU/g，随着发酵继续，酶活降至16.29 IU/g。

2.5 相关性分析

总多酚、总黄酮、总皂苷含量与抗氧化能力、酶活相关性分析结果如表1 所示。

表1 多酚、黄酮、皂苷含量和抗氧化能力、酶活相关性系数Table 1 Correlation coefficient of contents of polyphenols，flavonoids，and saponins with antioxidant activities and enzyme activities

由表1 可知，总多酚和总皂苷的含量与纤维素酶酶活呈极显著正相关。植物中多酚类物质大部分呈现结合态，与植物细胞中的细胞壁等结构所结合，该结果表明黑曲霉所产纤维素酶可能是促进总多酚、皂苷增加的主要原因，其能够酶解金银花细胞中细胞壁的纤维素，从而将结合态多酚、皂苷类物质转化为游离态，促进多酚和皂苷类物质释放的效果。此外，总多酚和总皂苷含量与抗氧化能力也呈显著相关，同时，总黄酮与·OH 清除率呈显著正相关。这表明发酵后金银花的增效主要归因于多酚、皂苷物质的释放。

3 结论

本研究通过黑曲霉固态发酵金银花，发酵后其DPPH·、ABTS+·、·OH 清除率、总还原力及透明质酸酶抑制率得到提高。同时，发酵后的金银花总多酚、总黄酮、总皂苷含量相较于未发酵组也得到提高。相关性分析结果表明，总多酚、总皂苷含量与抗氧化能力呈显著相关（P＜0.05），推测金银花中的多酚和皂苷类物质是其抗氧化能力的主要来源。此外，在黑曲霉固体发酵过程中，检测到纤维素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。同时，相关性分析结果表明，总多酚和总皂苷含量与纤维素酶酶活呈极显著相关（P＜0.01），表明多酚和皂苷释放主要归功于纤维素酶的产生。综上所述，推测黑曲霉固态发酵通过产出纤维素酶，酶解金银花细胞壁等结构，促进结合在其上的结合态多酚、皂苷释放，进而提高其抗氧化、抗过敏能力。本研究为金银花固态发酵及精深加工提供了一定的理论基础和依据。