中国红富士苹果糖、酸、多酚分析及产区溯源模型构建

刘毓超，王 辉，贾一鸣，张 晓，朱丽霞,3,

（1.塔里木大学食品科学与工程学院，新疆阿拉尔 843300；2.塔里木大学信息工程学院，新疆阿拉尔 843300；3.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

苹果是世界四大水果之一，在我国的种植面积与产量约占全世界总面积和总产量的50%[1]。而红富士苹果又是我国苹果栽种面积最大的品种，其产量超过我国苹果总产量一半之多[2]。我国红富士苹果主产区有黄土高原（陕、甘、晋、豫）、环渤海湾（辽、鲁）、西南冷凉（云、川）和新疆特色产区等[3]。红富士苹果的生长因受海拔和气候环境条件的影响，在不同种植地区的果实品质会存在一定差异。山东烟台果实形态外观端正，果肉甜脆[4]。云南昭通果实成熟后呈金黄色（部分）、果肉细腻[5]。陕西果实果形硕大且尺寸均匀、颜色鲜艳[6]。甘肃静宁果实脆甜汁多[7]。河南灵宝果实果面红润、酸甜可口[8]。新疆阿克苏果实皮薄肉脆，尤其果核周围形成了透明无色罕见的“冰糖心”结构[9]。随着我国苹果研究的不断深入和产业的不断发展，对苹果已从外在品质转入更深层次的内在营养品质的研究[10]。苹果营养品质包括风味[11]、滋味[11]、质地[12]、糖类物质[13]、有机酸[14]、多酚[15]、矿物质元素及微量元素[16]等。苹果果实营养品质是其商品等级划分的重要标志，从根本上决定其市场竞争力。近年来市场中出现假冒红富士苹果的现象，以新疆阿克苏红富士苹果为例，不仅扰乱真正阿克苏红富士苹果的销售市场，而且还破坏了其国家地理标志保护产品的称号，因此对各产区红富士苹果进行溯源并保护其地理标志显得尤为重要[17]。

农产品产地溯源是农产品溯源体系的重要组成部分，有利于实施农产品原产地保护战略，保护名牌，保护特色产品，稳定市场秩序[18]。常见的农产品溯源方法有感观特性评价、特征成分指纹图谱分析[19]、光谱分析[20]、基因技术[21]、稳定同位素法[22]、矿物元素分析[23]、微生物图谱[24]等。张雁鸣等[25]利用稳定同位素对不同省份的西瓜进行了溯源研究，可以实现新疆、广西、海南和山东4 个产地的西瓜样本区分；李富荣等[26]检测分析不同产地陈皮中32 种矿质元素含量的差异，筛选基于矿质元素指纹分析技术的有效产地溯源指标。上述溯源方法在检测分析时需依靠相关高精检测设备，但设备普及性相对较差，多数测试基于科研机构委托，使得市场应用受到限制，而且当地土地施肥、果实的果品和品级对溯源有不小的影响，使得溯源的精准度受制于果实品质品级。同时，这些检测分析手段，忽略了农产品市场消费者感兴趣的果品营养品质特色品质，使得地方果品特色品质的开发与市场应用受限。由此，基于地方果品营养品质，选用更为广谱性的检测分析方法，开发助于农产品特色品质挖掘与产业发展的新型溯源方式值得探索。

本文对多产区红富士苹果营养品质指标进行检测并结合产区气象因子分析，对比各产区果实糖、总酸、糖酸比、总酚、多酚等18 个营养品质指标差异。采用正交偏最小二乘判别分析和线性判别分析对果品地方特色品质评价指标进行筛选建模，同时筛选出的营养品质指标也可用于农产品溯源，不仅操作简单，而且节省成本，在能起到农产品追溯区分的同时可以为农产品产地和品牌的保护作用提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冰乙酸、丙酮、硫酸、硼酸、盐酸、β-羟基乙醇、邻苯二甲醛、抗坏血酸 均为分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；草酸、碘化钾、碘酸钾、酒石酸钾钠、硫酸钾、氢氧化钠、碳酸钠、无水乙醇、亚甲基蓝、亚铁氰化钾、乙酸锌、福林酚 均为分析纯，南京化学试剂有限公司；甲酸、甲醇 色谱级，天津赛孚瑞科科技有限公司；果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、儿茶素、表儿茶素、根皮苷、绿原酸、槲皮素糖苷类、槲皮苷、槲皮素鼠李糖苷、芦丁、槲皮素 均为标准品（含量≥99.9%），Sigma-Aldrich 公司。

DZKW-D-2 电热恒温水浴锅 中国北京永光明医疗仪器厂；CPA1245 万分之一电子天平 德国Sartorius 公司；UV-2450 紫外分光光度计、LC-20A高效液相色谱仪 日本Shimadzu 公司；TGL-20B高速台式离心机 中国上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集 于2021 年11 月份分别在山东烟台、甘肃静宁、河南灵宝、陕西洛川、云南昭通、新疆阿克苏6 个产区，选择成熟度相似的富士苹果若干（所选果树树龄相当，栽培管理和树势基本一致）、色泽相近、大小均匀、无机械损伤、无病虫害的果实用于实验。每个产区随机抽取苹果15 个，每3 个苹果混合取样（沿果实赤道线附近选取果肉），设置5 个重复实验。将选取果肉切碎并放置（-80 ℃冰箱）备用，为后期测定相关指标做准备。

1.2.2 指标测定 总糖含量参考GB/T 10782-2006[28]的方法；总酸含量参考GB/T 12456-2008[29]的方法；总酚含量参考福林酚法[30]测定；多酚含量参考贾一鸣[31]多酚测定方法；单糖含量参考刘玉莲等[32]单糖测定方法。

维生素C（VC）的测定：采用实验室改良滴定方法进行测定。取8 g 样品于150 mL 锥形瓶中，依次加入50 mL 2%草酸、1 mL 6%碘化钾溶液并滴加3 滴1%淀粉指示剂（现配现用），再用标定好的0.001 N（0.000167 mol/L）碘酸钾溶液滴定至铁青色（30 s 不褪色即滴定终点），进行3 次测定，并记录用量，同时做空白实验，通过碘酸钾滴定溶液消耗量计算维生素C 含量。

1.3 数据处理

测定的总糖、总酸、总酚、VC、多酚、单糖等，每个产区取15 个样品分5 组测定，每组数据测3 个平行。测定数据利用SPSS 25.0 进行不同产区间的方差分析、显著性分析和判别分析，相关性分析使用R 语言（pheatmap），用SIMCA13.0 进行正交偏最小二乘判别分析。

2 结果与分析

2.1 红富士苹果6 大主产区营养指标比较

由表2 可知，各地区果实营养品质指标存在差异，变异系数范围8.77%～43.23%。变异系数最大的营养品质指标为绿原酸43.23%，平均值为0.09 mg/g，含量变化范围0.02～0.18 mg/g；其次是山梨醇42.67%，平均值为5.18 mg/g，含量变化范围2.74～10.20 mg/g；再是芦丁37.82%，平均值为0.80 mg/g，含量变化范围0.49～1.77 mg/g，变异系数最小的营养品质指标是糖酸比6.86，平均值为56.84，含量变化范围43.54～61.98。纵观18 种果实营养品质指标，变异系数越大的绿原酸、山梨醇、芦丁、根皮苷和槲皮素等指标可以作为各产区果实的差异营养品质指标，且可以区分各产区果实。

由表3 可知，不同产区间果实总糖含量有所不同，新疆阿克苏地区红富士苹果总糖含量最高为13.66%±0.72%，与其他产区果实总糖有显著差异（P<0.05）；红富士苹果总酸含量各产区间存在显著差异（P<0.05），最高为新疆阿克苏地区总酸含量为0.25%±0.01%。糖酸比与果实的总糖总酸含量密切相关，新疆阿克苏、甘肃静宁和云南昭通红富士苹果糖酸比适中。研究表明，苹果风味品质主要取决于糖、酸含量及其配比关系，低糖高酸的果实口感过酸，高糖低酸的果实口感淡薄，都不符合鲜食要求[33]。本研究发现新疆阿克苏果实糖酸比趋于中等水平，该地区苹果口感更佳，与何引[34]对不同地区红富士苹果风味研究相一致；各产区红富士苹果VC含量除甘肃静宁和陕西洛川间无显著差异外（P>0.05），其余各产区果实相互间具有显著差异（P<0.05），且新疆阿克苏红富士苹果VC含量最高为5.28±0.2 mg/100 g，研究发现[35]果实中VC的含量与当地果园土壤所施氮肥和灌溉水量的大小均有关系。

果糖含量对于其他三类可溶性糖在各产区红富士苹果中含量最高，其中陕西洛川地区红富士果糖含量最高为82.49±0.56 mg/g 与其他产区具有显著差异（P<0.05）。各地区苹果果实中果糖的含量最高，葡萄糖和蔗糖含量次之，山梨醇含量较低。研究发现苹果、梨、草莓属于单糖积累型果树，其中果糖是苹果果实可溶性糖的主要组分，其次是葡萄糖、蔗糖[36]。Róth 等[37]研究发现，果糖是金冠、澳洲青苹、富士系等果实中主要的可溶性糖组分，其次是蔗糖和葡萄糖，山梨醇组分占比最低。本实验的结果与刘玉莲等[38]研究结果一致。新疆阿克苏、陕西洛川、云南昭通、山东烟台地区在山梨醇含量上有显著差异（P<0.05）且阿克苏产区果实最高为9.44±0.51 mg/g，与周文静等[39]研究发现“糖心”果实的出现，果实中山梨醇含量较高相符。又因阿克苏糖心苹果属于晚熟作物，新疆阿克苏属于高纬度地区，太阳辐射强白天日照时间长、光照充分，果实内部糖分能够大量积累，是由于有充裕的日照时间，从而促使果实能进行大量的光合作用，同时此地区夜晚时间相对较短，且昼夜温差大，减少作物的呼吸作用，有利于果实内部糖分积累[40-41]。Bowen 等[42]研究认为沙质土壤、酸性土壤和盐碱地以及老果园、有机质含量低的果园，常常会缺钙，导致果实钙含量偏低对“糖心”的形成和山梨醇的堆积有影响。郑朝霞等[43]对陕西省苹果主产区果园土壤特性进行研究，发现洛川地区土壤性质为中性偏碱，本研究发现陕西洛川产区果实山梨醇含量仅次于新疆阿克苏产区。在上述四种可溶性糖中山梨醇的变异系数最大，说明不同产区红富士苹果间山梨醇含量差异较大。

甘肃静宁、河南灵宝、山东烟台、新疆阿克苏等产区果实儿茶素含量存在显著差异（P<0.05），其中果实中儿茶素含量最低是新疆阿克苏产区0.05±0.003 mg/g；表儿茶素、根皮苷与绿原酸在各产区果实之间含量差异并不显著（P>0.05），槲皮素糖苷类、槲皮苷、槲皮素鼠李糖苷、槲皮素和芦丁在果实中的含量各产区间互有差异，河南灵宝果实槲皮素糖苷类含量最高为0.21±0.025 mg/g，云南昭通中槲皮苷含量最高为0.23±0.006 mg/g，果实中槲皮素鼠李糖苷含量最高的地区是云南昭通为0.19±0.017 mg/g，陕西洛川果实中槲皮素含量最高为0.06±0.003 mg/g，芦丁含量最高是河南灵宝产区果实为1.38±0.234 mg/g。结果说明不同产区富士苹果果实中多酚物质种类及含量均有差异，变异系数为22.16%～43.23%，其中绿原酸含量变异程度最大，儿茶素含量变异程度最小。结合表2 分析，产区果实营养品质指标变异系数较大，差异较为显著的指标均有代表该产区果实的特征，并能作为潜在区分各产区果实的有效因子。综上所述，自然环境、气候条件、土壤属性及施肥和灌溉方式是造成各产区红富士苹果中营养品质差异主要原因。

2.2 红富士苹果6 大主产区各类指标相关性分析

对6 大产区红富士苹果各类指标进行相关性分析，图1 结果表明各指标之间存在一定关性。总糖含量与蔗糖和山梨糖醇含量在P<0.01 差异水平下，呈极显著相关，尤其与山梨醇含量的相关性最强（r=0.64）。在P<0.01 差异水平下，总糖含量还与总酸和VC含量呈极显著正相关，与总酚、儿茶素、槲皮素糖苷类、槲皮素鼠李糖苷、根皮苷含量呈极显著负相关。果实的风味品质与其糖、酸等物质含量和配比关系紧密相关，适度的甜酸度的果实更容易让人接受[44]。蔗糖含量与葡萄糖、果糖、山梨醇含量表现出显著正相关（P<0.05），且与葡萄糖和山梨醇含量相关性极强（r=0.90、r=0.95），这与酶活性和糖代谢相关基因的差异有关，如蔗糖磷酸合酶（SPS）、蔗糖合酶（SS）是蔗糖积累的关键酶，酸性转化酶（AI）和NAD-SDH 主要调控己糖积累[45]。蔷薇科植物光合产物主要以蔗糖形式在源-库之间转运。此外，库细胞中韧皮部运输效率、糖的跨膜运输能力以及环境条件和栽培技术等外界因素也决定了果实糖分的积累[46]。VC含量与蔗糖、葡萄糖、山梨醇含量呈极显著正相关（P<0.01），与儿茶素和芦丁含量呈极显著负相关（P<0.01）。说明在果实中果实中VC含量与它们的含量彼此之间相互影响，研究表明VC与果实生长期的长短有密切关系，在果实的生长期中糖代谢又是关键的果实代谢途径。因而它们彼此之间存在紧密联系[47]。总酚含量与儿茶素和槲皮素糖苷类呈极显著相关（P<0.01），相关系数分别为0.67 和0.52，与蔗糖和山梨醇呈极显著负相关（P<0.01），相关系数分别为-0.49 和-0.53，与根皮苷、绿原酸、槲皮素呈显著相关（P<0.05）。儿茶素和表儿茶素含量都与根皮苷、槲皮素糖苷类和槲皮素鼠李糖苷含量呈极显著正相关（P<0.01），其中表儿茶素含量还与槲皮素含量呈极显著负相关（r=-0.50）。根皮苷含量与绿原酸、槲皮素糖苷类和槲皮素鼠李糖苷含量呈极显著正相关。说明多酚类物质含量彼此会受影响和约束。

图1 六大主产区红富士苹果品质指标相关性分析Fig.1 Correlation analysis of quality indexes of red Fuji apples in six major producing areas

2.3 红富士苹果6 大主产区各类指标正交偏最小二乘判别分析

正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和PCA相似，也是基于降维的多维向量分析方法。但是OPLS-DA 为有监督的分析，可以预设分类，弥补了PCA 方法的不足，强化组间差异，同时可以量化特征化合物造成组分差异的程度。由图2A 可知，各主产区红富士苹果营养品质指标含量存在显著性差异，OPLS-DA 分析可以实现6 大产区红富士苹果的良好分离。OPLS-DA 模型为Q2值0.794，矩阵R2X值0.885，区分参数R2Y 值0.874，说明该模型对6 大产区红富士苹果具有良好的稳定性和较好的预测能力。变量投影重要性（variable important in projection，VIP）可以进一步量化OPLS-DA 的每个变量对样品分类的贡献。VIP 值越大，变量在不同样品间的差异越显著，通常可以将VIP>1 表示为关键变量。由图2C 所示，VIP>1 品质指标为果糖、槲皮苷、槲皮素、芦丁、槲皮素鼠李糖苷、VC、葡萄糖、总酚，以上8 个指标可以作为更好区分不同产区果实的品质指标。由表4 可知，在OPLS-DA 模型中，利用18 种营养品质指标对阿克苏、灵宝、洛川、烟台和昭通产区果实判别正确率达100%，静宁产区果实判别率为60%，无法判别的产区果实，产区果实总体判别正确率为93.33%。

图2 不同产区红富士苹果品质指标OPLS-DA 建模结果Fig.2 Modeling results of OPLS-DA for quality indicators of Red Fuji apples in different producing areas

2.4 基于线性判别分析的红富士苹果产地判别模型

应用线性判别分析函数对不同产区红富士苹果进行判别分析，通过共线性诊断分析，选取检测的18 项指标作为自变量，不同红富士苹果产地作为分组变量，建立红富士苹果不同产地判别模型如下：

图3 为判定函数1 和判定函数2 区分阿克苏、静宁、灵宝、洛川、烟台和昭通产区红富士苹果的散点图。通过威尔克Lambda 分析，假设显著性水平（α=0.05），判别函数1 和判别函数2 对分类结果达到显著水平，其判别结果可接受。判别函数1 的方差百分比为48.7%，相关性为0.998；判别函数2 的方差百分比为32.4%，相关性为0.997；选取判别函数1 作为主要判别函数对红富士苹果不同产地判别的主要依据。根据不同红富士苹果产区，划分为阿克苏、静宁、灵宝、洛川、烟台和昭通6 类。在F值（3.84～2.71）下选取VC、山梨醇、儿茶素、槲皮素糖苷类、槲皮苷、槲皮素鼠李糖苷、芦丁和槲皮素8 个指标可以明显判别出红富士苹果的产地，这说明威尔克Lambda 判别分析有效。

图3 判别函数区分红富士苹果产区散点图Fig.3 Scatter map of red Fuji apples producing area by discriminant function

式中，1～6 分别代表阿克苏、静宁、灵宝、洛川、烟台和昭通地区；A 为测定VC值、B 为测定山梨醇值、C 为测定儿茶素值、D 为测定槲皮素糖苷类值、E 为测定槲皮苷值、F 为槲皮素鼠李糖苷值、G 为测定芦丁值、H 为测定槲皮素值。

不同产地红富士苹果的判别分析结果如表5 所示。根据判别模型对阿克苏、静宁、灵宝、洛川、烟台和昭通6 个产区的红富士苹果样品进行分类，利用回代检验（原始）和留一交叉验证对判别模型进行检验。阿克苏、静宁、灵宝、洛川、烟台和昭通6 个产区的红富士苹果样品回代检验的整体判别率均为100%，对于以上6 个产区留一交叉验证的判别率也均为100%（表5）。

2.5 红富士苹果6 大主产区环境因子与各类指标相关性分析

对生长期红富士苹果各产区温差，降雨量2 项环境因子（表1）和18 种营养品质指标（表3）进行相关性分析，结果（图4）表明，在P<0.05 的条件下，果实生长期温差与红富士苹果的蔗糖含量呈显著正相关（r=0.82）；果实生长期降雨量与红富士苹果的总酸含量和总糖含量呈显著负相关（r=-0.86，r=-0.81），多酚类物质与降雨量呈正相关，与果实生长期温差呈负相关。干旱地区降雨量相对较少，其果实总糖含量，总酸含量越大与降雨量显著负相关，这与孙智广等[48]研究结果相似；蔗糖含量与温差呈显著正相关，说明温差越大，降雨量越少果实的糖分代谢越强，这与殷淑燕等[49]研究结果一致。

图4 红富士苹果主产区环境因子与指标相关性分析Fig.4 Correlation analysis of environmental factors and indicators in main Red Fuji apples producing areas

表1 不同苹果（生长期）产区信息Table 1 Information on different apple (growing season)producing areas

表2 不同产区品质指标结果分析Table 2 Analysis of quality index results in different production areas

表3 各主产区红富士苹果品质指标对比Table 3 Comparison of quality indicators of red Fuji apples in the main producing areas

表4 不同产区红富士苹果OPLS-DA 判别分析结果Table 4 OPLS-DA discriminant analysis results of red Fuji apples in different producing areas

表5 不同产区红富士苹果的判别结果Table 5 Discrimination results of red Fuji apples from different producing areas

3 结论

本研究对新疆阿克苏、甘肃静宁、山东烟台、陕西洛川、河南灵宝和云南昭通等6 大主产区红富士苹果18 个营养品质指标分析，明确了红富士苹果种营养品质指标存在地域差异。在糖类方面，阿克苏红富士苹果山梨糖醇含量偏高，陕西洛川红富士苹果果糖含量偏高；在多酚物质方面，甘肃静宁红富士苹果绿原酸含量偏高，河南灵宝红富士苹果儿茶素和根皮素等含量偏高，云南昭通红富士苹果槲皮苷和表儿茶素等含量偏高，山东烟台红富士苹果芦丁等含量偏高，陕西洛川红富士苹果根皮苷含量偏高；新疆阿克苏红富士苹果总糖含量偏高，甘肃静宁红富士苹果总酚含量偏高，烟台红富士苹果糖酸比含量偏高。采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和线性判别分析建立模型，OPLS-DA 模型可以将6 大主产区红富士苹果样品93.33%准确识别，通过VIP 值确定了果糖、槲皮苷、槲皮素、芦丁、槲皮素鼠李糖苷、VC、葡萄糖、总酚8 个有效区分指标。基于线性判别分析，选取VC、山梨醇、儿茶素、槲皮素糖苷类、槲皮素鼠李糖苷、槲皮苷、芦丁和槲皮素8 个特征营养品质指标建立的判别模型，6 个产区红富士苹果回代检验（原始）和留一交叉验证的整体判别率均为100%。本论文再次证明环境因素对果实糖积累有影响，得到总糖和总酸含量与降雨量显著负相关（P<0.05），蔗糖含量与温差呈显著正相关。因此，利用多品质指标化学计量法对不同产区红富士苹果判别是有效可行。对于构建判别模型时，所选用的样本数量越多，该模型也越有说服力，为确保判别模型的准确判别率，今后还需要继续增加样品数量，来不断修正判别模型的各项系数。建立多指标判别模型对富士苹果产区进行划分，有利于实现我国果实品质调控和品牌维护，为不同产区富士苹果溯源和质量控制提供了基础依据。