基于光声泵浦成像的氧分压测量定量分析*

何霄 肖小舟 何滨 薛平 肖嘉莹†

1) (中南大学基础医学院生物医学工程系,长沙 410083)

2) (清华大学物理系,低维量子物理国家重点实验室,北京 100084)

光声泵浦成像是一种新型的高特异性光声分子影像技术.它可以避免常规光声成像中来自血液等强背景信号的干扰,实现组织中微弱目标分子的探测,并通过对泵浦-探测激光间的延时扫描,获得组织中的氧分压分布.本文采用亚甲基蓝作为分子探针,通过对血红蛋白溶液中氧分压变化的监测,开展了对光声泵浦成像的定量分析研究.本文采用高斯噪声模型,获得了三重态差分信号稳定性随着平均次数变化的规律,并在此基础上对氧分压测量的误差进行了分析.结果表明,在平均次数为200 次条件下,氧分压在300—550 mmHg(1 mmHg=133 Pa)区间内,所搭建系统的检测精度优于33 mmHg.本研究将对光声泵浦成像技术的进一步发展和应用起到重要的指导作用.

1 引言

光声成像(photoacoustic imaging,PA)是一种新型的生物医学无损成像方式[1].它通过收集脉冲激光照射组织所产生的超声波进行成像,因此兼具了光学成像丰富的分子影像功能和超声成像的高穿透深度的优势,在基础医学和临床医学中显示了出巨大的应用潜力.

光声成像作为一种大深度分子影像手段,其主要依赖目标分子的特异性光吸收进行探测[2].然而,由于光声成像中入射激光主要被血液中的血红蛋白所吸收,所以常规的光声成像通常用来对组织中的血管网络或血氧分布进行成像.当目标分子浓度较低时,其产生的微弱的光声信号就会被淹没在血液等强背景光声信号中[3,4].因此,常规的光声成像仅能对高浓度的造影剂进行成像[5].

光声泵浦成像是一种基于泵浦-探测的新型光声分子影像技术[6,7].由于生物组织分子的激发态寿命通常仅有皮秒或纳秒的量级,激发后会快速衰减到基态.而对于亚甲基蓝等卟啉类分子,其三重态寿命可达微秒量级.因此光声泵浦成像可以通过探测光信号的差分,排除血液等强背景光声信号的干扰,对处于三重态的该类分子实现高选择性的探测.因此,光声泵浦成像可以结合现代分子探针技术,实现大深度、高特异性的目标分子成像[8].此外,光声泵浦成像还可以通过对三重态寿命的探测,在不依赖于探针浓度的情况下获得生物体内氧分压的分布[9,10].在近期的工作中,本课题组提出了一种新颖的脉冲激光延迟调节技术[11],实现了快速自动化的光声泵浦成像,并通过交错采集的方法,有效抑制了激光器能量的波动,显著地提升了光声泵浦成像的速度和精度,使得该技术在光动力治疗监测等临床中的应用成为了可能[12].

然而,目前光声泵浦成像技术的研究仍处于初始阶段.首先,光声泵浦成像需要进行大量的信号平均,以获得高信噪比的三重态差分图像,但是目前缺乏相关的图像稳定性的研究.此外,基于该技术的氧分压监测目前也仍处于定性研究阶段,同样缺乏相关的误差量化分析研究.为此,本文搭建了一套基于亚甲基蓝的光声泵浦氧分压检测系统,通过对牛血红蛋白溶液中氧分压的监测,展开对光声泵浦成像技术的定量研究.本文将对信号平均次数与三重态差分信号稳定性之间的关系进行量化分析,并进一步对所测氧分压的不确定度进行研究,从而对基于光声泵浦的氧分压测量的稳定性和准确性进行评估,为该技术的进一步发展和临床应用提供依据.

2 研究方法

2.1 基于光声泵浦的氧分压测量原理

光声泵浦技术原理如图1 所示.采用两束脉冲激光照射样品,其中泵浦光用来将目标分子激发到激发态,由探测光对处于激发态的目标分子进行探测.当卟啉类分子(如亚甲基蓝)被泵浦光激发时,它会从基态S0激发到激发单重态S1,然后通过系间窜越(intersystem crossing,ISC)转变为三重态(T1),由于自旋禁制的作用,这类T1态分子相对稳定,寿命为微秒量级.因此在探测光照射时,仍然有大量分子处于T1态.然而,生物组织内大多数分子激发态寿命仅为皮秒纳秒量级,泵浦光照射后会迅速衰减,处于激发态的分子很少.因此,可通过是否存在泵浦光时所得的光声信号的差分,选择性地获得T1态分子的光声信号.这样,就可以排除组织内的血液等其他光吸收物质的背景信号,实现对卟啉等具有T1态的分子的高特异性成像.上述光声差分检测方法称为瞬态三重差分(transient triplet differential,TTD),计算公式如下:

其中,STTD,t=τ是通过差分去除背景后得到的TTD信号,Spump+probe,t=τ是泵浦和探测光同时激发时的光声信号,Spump,t=τ是仅泵浦光激发产生的泵浦光信号,Sprobe,t=τ是仅探测光激发产生的探测光信号,τ 表示探测激光相对于泵浦激光的延迟时间.

值得注意的是,T1态分子可与生物组织中的氧分子相互作用并发生动态淬灭(分子氧得到能量变成单线态氧,T1态分子失去能量返回基态S0),使处于T1态分子的寿命进行缩短,因此可通过T1态的寿命计算得到组织中的氧分压(oxygen partial pressure,pO2).TTD 信号幅值和T1态寿命的关系为

其中,A(t) 代表延迟时间τ=t时的TTD 信号,A0代表TTD 信号衰减前的幅度,而T则是估计得到的T1态寿命.通过以下公式可将寿命T转换为生物组织中的pO2:

其中,T0代表当pO2=0 mmHg 时的T1态寿命,而kQ则是淬灭速率常数.对于亚甲基蓝分子而言,T0=79.6 μs,kQ=0.0036 μs-1·mmHg-1.

2.2 光声泵浦氧分压检测系统

该系统结构组成见图2(a),包括两台OPO 可调谐激光器(SpitLight OPO 600)、一台数字延迟/脉冲发生器(DG645,Stanford Research Systems,CA)、一个5 MHz 水浸超声平探头(中心频率5 MHz、晶元尺寸6 mm、带宽80%,常州道博超声电子有限公司定制)、脉冲接收/发射器(DPR500,Imaginant,NY)以及一张数据采集卡(NIPCI-5124).其中泵浦OPO 激光器由355 nm 光泵浦,采用665 nm对亚甲基蓝激发,另一台OPO 激光器由532 nm光泵浦,用于产生830 nm 的探测光.两台激光器重复频率均为20 Hz.泵浦和探测激光器通过一个二向色镜耦合到 1×2 光纤束中.光纤束的输出端是两个1.5 mm×3.5 cm 的矩形状输出口,固定在线性超声阵列的两侧,如图2(b)所示.泵浦激光器在样本上的激光能量密度为15 mJ/cm2,探测激光为23 mJ/cm2,均在人体安全阈值之内[13].

采集数据时的序列流程如图2(c)所示.在光声泵浦成像中,通过DG645 在50 ms 的周期内产生4 种相互之间有设定延时的脉冲,分别作为两台激光器的Flash和Q-switch 触发信号.同时,探测脉冲的触发信号也作为5124 采集卡的采集触发信号.当激光器出光后,照在样品上产生光声效应,通过超声探头采集信号并传输到DPR500 将信号放大,接着传输到5124 采集卡采集并保存到主机.通过上述步骤采集到Spump+probe,t=τ,Spump,t=τ和Sprobe,t=τ三种序列的数据,再经过差分后获得TTD信号.由于OPO 激光器需要稳定工作在20 Hz,所以泵浦光和探测光总会同时出光.为获取仅存在泵浦光或者探测光时候的光声信号,本文采用一种激光脉冲延迟调节技术,使用DG645 将OPO 泵浦光或探测光相对于采集卡触发信号向后调制一段时间(如1 ms 左右),这样就可实现三种采集序列的快速自动采集.在此基础上,三种序列采用交错采集的方式,从而避免了激光器能量长周期波动的影响,有利于降低平均次数,提高采集效率.

本文中所测样品为掺有100 mg/mL 牛血红蛋白的亚甲基蓝溶液(浓度为400 μmol/L).为改变溶液的pO2,本文搭建了一套相对密闭的溶液循环装置,包括一个二口烧瓶、一个三口烧瓶、气体流量计、两个蠕动泵及其软管和一个与软管连通的透明塑料装样管.通过气体流量计将氧气和氮气分别通入三口瓶的溶液中,并借助气体流量计调节两种气体的通入速率来改变溶液的pO2,如图2(b)所示.

2.3 材料与氧分压实验设计

亚甲基蓝是一种芳香杂环化合物,其分子式为C16H18ClN3S,常被用作化学指示剂、染料等[14].作为一种临床上使用的注射药物,已经通过美国食品药品监督管理局的批准[15,16],并在近年来被广泛应用于各种光动力治疗的相关研究中[17,18].本文确定了亚甲基蓝的S0态吸收峰为665 nm,其T1态的最大吸收峰为830 nm 左右.为确定亚甲基蓝T1态的最大吸收峰,本文用400 μmol/L 的亚甲基蓝溶液进行了光声光谱扫描实验(平均次数n=500),并通过(1)式计算得到不同探测波长下的TTD 信号,从而获得其T1态的瞬态光吸收谱.

TTD 信号的波动性是光声泵浦成像系统稳定性的重要表征,直接影响到信号平均次数的选择与检测结果的准确性.为考察血红蛋白浓度以及亚甲基蓝浓度对TTD 信号的影响,本文进行两组对比实验.在第1 组实验中,样品溶液中的亚甲基蓝浓度为400 μmol/L,共设置了100,50 和0 mg/mL三种不同浓度的牛血红蛋白测试样品.其中,100 mg/mL 与人体血红蛋白浓度相似,可用于模拟正常血液条件.第2 组实验中,牛血红蛋白的含量为0 mg/mL,亚甲基蓝的浓度分别为50,100,200 和400 μmol/L.信号的平均次数为200 次.

为获得系统在不同pO2下的测量误差,本文采集了6 组不同pO2下的光声泵浦数据,其对应的氮气和氧气通入速率的比值分别为1∶0.25,1∶0.5,1∶0.75,1∶1,1∶1.5 和1∶2.在每个氮氧比下循环通气30 min 后,采集不同延迟下管中样品的TTD信号,并通过数据拟合得到T1态寿命和pO2.为了平衡采集时间和数据准确性,平均次数n设置为200 次.泵浦和探测光之间的延迟时间共有10 个,分别为0,0.5,0.75,1,1.5,2,2.75,3.5,4 和6 μs.

2.4 数据处理与分析方法

在光声泵浦成像中,pO2是通过T1态寿命T转化得到的,而T是通过对不同延时τ 下采集得到的TTD 信号拟 合得 出,因 此pO2测量的准确性和TTD 信号密切相关.TTD 信号既会受两台OPO激光器脉冲能量波动的影响,也会受到组织内血液等背景信号的干扰,因此需要大量样本数据取平均值,才能获得可靠的数据.基于以上原因,研究平均次数对TTD 的测量误差之间的关系显得尤为重要.

本文采用交错采集的方法获取TTD 数据,可认为单次测量得到的TTD 信号符合随机独立分布[19].因此,本文通过多次采集得到TTD 的样本标准差s,来估算平均后TTD 信号的标准误差(standard error of the mean,SEM),计算公式为[20]

式中,n为平均次数;TTD 信号的样本标准差s计算公式为[21]

其中,xi为样本中第i个检测值,为样本均值.

由(4)式可知,TTD 平均后的测量误差是随着平均次数n的增大而减小,但在实际的pO2测量中,由于采集的数据量较大,平均次数过高会导致采集时间过长,所以需要平衡采集时间和数据准确度之间的关系,合理地设置平均次数n.

为对不同pO2下光声泵浦检测的误差进行评估,本文以TTD 标准误差 SE 为基础,采用高斯噪声模型,模拟生成不同pO2不同延时下的测量数据,然后拟合处理得到pO2数值,通过统计分析获得系统pO2测量的不确定度.模拟得到的TTD 数据As(τ,p)如下式所示:

其中,Ae(τ,p)和SE(τ,p) 分别是氧分压为p、延迟为τ条件下,实验测得的TTD 信号幅值和标准误差,RAD 为采用box-muller 方法生成的“服从标准高斯分布”的随机数[22].对每个不同的,本文模拟生成了10000 组测量数据,其中每组测量的信号平均次数为200 次.

3 实验结果

3.1 亚甲基蓝的瞬态吸收谱

亚甲基蓝的基态(S0)光吸收谱可由分光光度计获得,其吸收峰在665 nm,如图3(a)所示.因此,本文采用665 nm 作为激发波长,测量了亚甲基蓝T1态的吸收光谱(如图3(b)).实验结果表明,在700—900 nm 的波长范围内,MB 溶液的TTD信号首先随波长的增大而增加,在755 nm 处上升趋势变缓慢,随后又逐渐上升,在830 nm 左右达到峰值,之后逐渐减小.因此,本文最终选择830 nm作为探测光波长.

图3 亚甲基蓝的基态和激发态吸收光谱 (a) 基态吸收光谱图;(b) 经能量校正后的T1 态吸收光谱图Fig.3.Ground-state and excited-state absorption spectra of methylene blue: (a) The absorption spectrum of the ground state;(b) the energy-corrected absorption spectrum of the T1 state.

光声泵浦成像能够通过信号差分的方法去除血液等强背景信号,获得T1态分子的光声信号.图4(a)为400 μmol/L 亚甲基蓝溶液采集100 次平均后得到的Spump+probe,τ=0,Spump,τ=0,Sprobe,τ=0和STTD,τ=0信号.可以看出,亚甲基蓝的泵浦光和TTD 信号都明显大于探测光,这证明了亚甲基蓝有较高的基态和T1态激发效率.对于单次测量的TTD 信号,提取其在图4(a)中TTD 平均信号峰值处(黑线)的值,可得100 次测量TTD 信号幅值的分布,如图4(b)所示.可以看出,TTD 幅值围绕其均值(红线)在上下波动,其波动幅度代表了测量系统的稳定性.

图4 通过光声泵浦成像得到的光声信号 (a) 归一化后的MB 的光声信号示意图;(b) 归一化后的TTD 幅值分布图(基于平均值归一化)Fig.4.Photoacoustic signals obtained through photoacoustic pump-probe imaging: (a) Schematic representation of the normalized photoacoustic signal of MB;(b) normalized distribution of TTD amplitude (normalized to the mean).

3.2 TTD 信号波动性的影响因素研究

图5(a)显示了不同浓度牛血红蛋白溶液归一化后TTD 标准差(橘红色虚线),以及归一化后的泵浦光信号的幅值(蓝色虚线).可以看出,随着样品中血红蛋白浓度的加大,其泵浦光信号逐渐增大,同时其TTD 幅值的波动性也在加大.其中,泵浦光信号的增大是由于溶液光吸收系数的增大.由于各组测量相对独立,因此泵浦光信号的增加必然造成泵浦光信号标准差的增大.而由(1)式和(5)式可知,其也会造成TTD 信号标准差的增大.

图5 TTD 信号波动性分 (a) 含不同浓度牛血红蛋白的TTD 标准差;(b) 含不同浓度亚甲基蓝溶液的TTD 标准差Fig.5.Analysis of TTD signal variability: (a) TTD standard deviation with different concentrations of bovine hemoglobin;(b) TTD standard deviation with different concentrations of methylene blue solution.

另外,当溶液中血红蛋白含量一定,仅亚甲基蓝浓度发生变化时,可见TTD 的标准差始终保持在8%以下(图5(b)).这是因为在牛血红蛋白浓度一定的情况下,溶液中亚甲基蓝的浓度变化并不会引起其光吸收系数的太大改变.这两组实验结果表明,在亚甲基蓝浓度较低的条件下,光声泵浦成像的稳定性主要受到样品背景信号波动的影响,背景信号越强,TTD 信号的幅值波动越大.

3.3 光声泵浦对氧分压的定量分析研究

由于测量单组TTD 衰减曲线所需时间(平均200 次)可达10 min,所以本文根据实验测量得到的TTD 数值及其标准差,通过数值模拟的方法获得了1 万组TTD 衰减曲线,来对测量的准确性进行评估.因此,对于单个可拟合得到1 万个T1态寿命.图6(b)为氮氧比为1∶0.25 的条件下,对模拟所得的1 万个T1态寿命排序后得到的累计分布图.图中横坐标是排序后的样本序号,纵坐标为T1态寿命.可以看出,所得T1态寿命T分布在0.85—0.97 μs 之间.此外,数据拟合结果表明,这1 万条TTD 衰减曲线的拟合优度R2均在该组原实验数据的 ±2% 范围内,表明了在均次数200 次时获得了较好的测量准确性.

图6(c)为根据图6(b)所得的累积概率积分曲线.对该曲线进行微分即可得概率密度分布曲线,如图6(d)中红色点状曲线所示.图6(d)中蓝色曲线为概率密度分布曲线多项式拟合后所得平滑后的曲线,其能克服模拟次数的限制,更好地反映系统pO2测量值的概率密度分布.可以看出,该组氮氧比下最大似然的T1态寿命为0.9094 μs,相应的95% 置信区间为0.8833—0.9375 μs.

通过(3)式将每组模拟所得的T1态寿命转化为值,即可得检测值的统计分布.图6(e)显示了6 组不同氮氧比下最大似然的数值,与其对应的T1态寿命.图中曲线上标注的误差棒为T1态寿命的95%置信区间.将图6(e)中绿色圈所示数据(氮氧比为1∶1)放大可得图6(f).可以看出,其T1态寿命测量值在0.641—0.672 μs 范围内波动,对应的在409.7—429.6 mmHg 范围内波动,测量误差约为最优值的4.75%.同理,也得到了其他组的测量误差,分别为4.53%,5.01%,5.84%,4.75%,5.73%,5.69%.可见,本文中光声泵浦氧分压检测系统的测量误差总体保持在6%以下,具有较高的测量准确性.

4 讨论

传统的光声成像由于受到强血液背景信号的干扰,其分子影像能力较弱.相对地,光声泵浦成像可以通过对亚甲基蓝等具有长寿命T1态的探针分子的泵浦-探测,实现深层组织中的微弱目标分子的高特异性成像.此外,光声泵浦成像还可以实现不依赖于探针浓度的组织氧分压的定量检测,在肿瘤、神经和心血管等的临床诊断中有广泛应用前景.然而,光声泵浦成像长期以来一直在成像速度、稳定性和准确性等方面面临挑战.虽然本课题组提出的激光脉冲延迟调节技术,以及其他一系列新型脉冲序列设计方法,有力地提升了其成像速度和质量,但是总体上光声泵浦成像的研究仍处于初级阶段,对其成像稳定性和准确性的定量分析研究还非常少.

光声泵浦成像以TTD 差分成像为基础.在TTD信号波动性分析中,本文采用高斯噪声模型来评估该技术方法的检测性能.显然,随着平均次数的增加,TTD 信号的噪声会显著减少,进而提升图像的质量和可靠性.然而,需要注意的是,增加平均次数会导致时间分辨率的降低,并且过长时间的连续采集会导致激光出光能量逐渐衰减,进一步影响成像的准确性.因此,在选择平均次数时需要权衡稳定性和时间分辨率之间的关系,根据具体需求进行平衡.在本研究中,采集一组氧分压数据所需的时间为5 min.如果需要提高系统的时间分辨率,需要降低背景血红蛋白浓度,或者降低对系统检测精度的要求.对于氧分压变化本文研究还表明,与不同亚甲基蓝浓度的影响相比,背景信号的强度是影响TTD 信号稳定性的关键因素.

本文的研究结果将有助于对基于光声泵浦的氧分压测量方法的理解,并为该技术的进一步优化和实际应用提供指导.例如在光动力治疗中,光声泵浦成像技术有望对深层组织的光敏剂和变化进行实时无损成像监测,从而通过术中治疗光的实时调整,提高光动力治疗效果并减少副作用.因此,对光声泵浦成像方法成像精度和准确性的研究,将有助于对成像速度、泵浦-探测延迟时间,及其他相关监测参数的优化,以及对所得光敏剂和图像的理解,从而有助于进行合理的治疗干预决策,助力个体化的精准诊疗.虽然本文仅通过仿体实验,对基于光声泵浦的氧分压监测方法进行初步的定量研究,但建立的相关理论框架和数据分析方法,将可用于后续的在体研究中.

5 结论

光声泵浦成像通过差分探测的方法获得探针分子激发态信号,进而通过衰减分析获得样本中的氧分压.这个过程需要经过多个复杂的信号处理步骤.为了定量研究该方法,本文搭建了一套基于光声泵浦的氧分压监测系统,并通过高斯噪声模型,首次建立了基于光声泵浦的氧分压测量误差分析方法,并分析了系统对掺有亚甲基蓝的血红蛋白溶液在不同氮氧比下的氧分压测量误差.结果表明,该系统在200 次样本平均条件下,在300—550 mmHg的氧分压区间内,其检测误差范围保持在6%以下.本文相关研究结果将推动光声泵浦技术的进一步发展和应用.