蒙古口蘑菌种培养基的筛选研究

徐伟良李春冬隋业璇李林瑛李凤忠郭梁

(1.锡林郭勒职业学院生物工程研究院，内蒙古 锡林郭勒 026000；2.锡林郭勒盟坤源生物科技有限公司，内蒙古 锡林郭勒 026000)

蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum Imai.)，又名蒙古白丽蘑。1937年由日本学者今井三子(S.Imai)定名发表，2011年姚一建等通过系统发育学研究，将其又重新划分并组建为白丽蘑新属(Leucocalocybe)，因此蒙古口蘑又被称作蒙古白丽蘑(Leucocalocybemongolica(S.Imai)X.D.Yu&YJ.Yao)，现属口蘑科(Tricholomataceae)白丽蘑属(Leucocalocybe)[1，2]。随着气候的变化、草原的退化以及人为破坏性采摘等因素的影响，2021年，蒙古口蘑被列入《国家重点保护野生植物名录》，成为二级濒危保护物种。野生蒙古口蘑种群数量的减少甚至濒危亟需科学的研究保护，据报道蒙古口蘑现只分布在呼伦贝尔市以及锡林郭勒盟等旗县地区。

目前，蒙古口蘑相关研究仅停留在遗传多样性[3]、菌种发酵[4]、生物活性成分(多糖、蛋白质、多肽、甾体等)[5-7]等方面。现阶段，蒙古口蘑的人工栽培和驯化也处于实验室研究阶段，唯一成功的报道是在20世纪90年代，田绍义等[8]报道以麦秸、棉籽皮为原料驯化栽培出蒙古口蘑。食用菌液体培养相比传统固体培养基具有培养周期短、菌种生长均匀、生产成本低、易于调控、便于接种、减少污染等优点，因此有学者对蒙古口蘑的液体进行了研究。吴晓彤[9]经过研究确定蒙古口蘑在摇瓶发酵时的最佳培养条件为接种量12%，温度25℃，转速150r·min-1。

本研究通过蒙古口蘑野生子实体的分离、鉴定、培养获得口蘑菌种资源，选取不同种类的固体、液体、栽培种培养基进行筛选研究，为后续蒙古口蘑的人工驯化提供优质菌种，以期通过科学手段保护和开发锡林郭勒蒙古口蘑资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

蒙古口蘑子实体采自于锡林郭勒盟草原；青干草、牛粪、木屑购自于锡林浩特市牧民家；马铃薯、小麦、玉米粉等购自于锡林浩特市农贸市场。

1.1.2 试剂

EasyTaq PCR Super Mix，北京全式金生物技术有限公司；ITS引物合成，北京睿博兴科生物科技有限公司；维生素B1、酵母浸膏、蛋白胨、琼脂(生化试剂)及其余分析纯试剂均购自国药集团。

1.1.3 培养基

固体培养基参考本研究团队郭梁等研究[10，11]，选取马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)、PDA加富培养基及改良PDA培养基3种作为筛选培养配方。

液体培养基参考本研究团队隋业璇等研究[12，13]报道的4种液体培养基配方。

栽培种培养基配方3种，参考许修宏研究方法[14]。栽培种培养基1：玉米1.0kg，石膏50.0g，麸皮50.0g，木屑200.0g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸馏水根据湿度添加；栽培种培养基2：小麦1.0kg，石膏50.0g，麸皮50.0g，牛粪120.0g，青干草120.0g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸馏水根据湿度添加；栽培种培养基3：高粱1.0kg，石膏50.0g，麸皮50.0g，木屑200g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸馏水根据湿度添加。

1.2 仪器与设备

YC-R50恒温培养摇床和202-3A电热恒温培养箱，赛默飞世尔科技公司；2720 Thermal Cycler PCR扩增仪，美国BIO-RAD公司；SW-J-2FD超净工作台，苏州博莱尔净化设备有限公司；MLS-3751L-PC高温高压灭菌锅，日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 蒙古口蘑子实体与菌丝体分子鉴定

分别取蒙古口蘑子实体和菌丝体样品进行DNA鉴定。将蒙古口蘑子实体样品清洗消毒，用镊子取菌盖内部的子实体样品50mg放入1.5mL试管中，用剪刀搅碎后备用；菌丝体样品是先将菌丝球用纱布过滤，用无菌水清洗后，称取50mg湿重样品放入1.5mL试管中捣碎作为DNA提取样品。使用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒进行DNA提取，选用通用引物ITS1和ITS4进行扩增。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共34循环；72℃加强延伸10min。将获得的扩增产物进行测序，测序结果经NCBI数据库进行BLAST同源比对。

1.3.2 菌丝体固体培养基的筛选

选取生长良好的蒙古口蘑子实体，按照无菌操作对蒙古口蘑子实体纵剖，在蒙古口蘑子实体上划不同的4个位置用接种钩勾取3mm×3mm×3mm大的块状组织，放置在PDA培养基中，在25℃恒温培养箱中初步培养。用打孔器在初步培养后的培养基上取生长速度和大小相同的菌丝块放在3种不同的固体培养基中进行培养，观察并每日记录，直至菌丝长至培养皿边缘。用电子万用炉加热溶解3种固体培养基培养，使琼脂溶解在培养基内，用无菌纱布进行过滤。将菌丝放在预先称量好的培养皿中，放置于80℃状态下烘干，取出后冷却至恒重再称量。

1.3.3 菌丝体液体培养基的筛选

在筛选出的固体培养基上，选取菌丝长势相似位置，用打孔器选取16个直径均为1cm的菌块，4个为1组，分别接种于100mL 4种不同液体培养基中，并放入25℃恒温摇床培养箱中培养5d。随机取10个培养好的菌丝球排成直线，测量其长度，然后除以10即为菌丝球的平均直径，重复3次，取平均值。再将菌丝球放在纱布上过滤，用无菌水清洗后，于80℃下烘干4h，冷却至室温称重，利用公式计算菌丝体生物量[11]。计算公式：

菌丝体生物量(g·L-1)=菌丝体干重/培养液体积

(1)

1.3.4 菌丝体栽培种培养基的筛选

挑选当年收获的无虫蛀、无霉变的小麦、玉米、高粱，清洗去除灰尘杂质，并按栽培种培养基配方进行混料，在121℃高温高压灭菌锅中，灭菌120min，待冷却后放入超净工作台中备用。在无菌环境操作下，将筛选出的最优液体培养基B按照培养基重量的3%分别接种在以玉米、麦粒、高粱为主料的3种栽培种培养基中，并置于25℃的恒温箱中培养。观察并记录菌丝吃料深度，根据率先长满栽培瓶的时间和菌丝吃料深度筛选出最优栽培种培养基的配方。

2 结果与分析

2.1 子实体与菌丝体的分子鉴定

将采集得到的蒙古口蘑子实体和菌丝体分别进行DNA提取，进行PCR扩增和凝胶电泳验证。由图1可知，蒙古口蘑的DNA扩增产物条带在600bp左右，经DNA测序后进行NCBI序列比对表明，与数据库中蒙古口蘑基因序列相似性为100%，确定子实体与分离得到的菌丝体均为蒙古口蘑。

图1 蒙古口蘑分子鉴定

2.2 蒙古口蘑菌种固体培养基的筛选结果

利用选取的3种固体培养基对蒙古口蘑菌种进行筛选培养，连续观测32d记录菌丝的生长状况，以菌丝干质量和菌丝长度为评价指标，通过统计分析筛选出最适蒙古口蘑菌种生长的固体培养基配方，结果见图2～4。通过观察测量菌丝长度发现，在3种培养基上菌丝长势呈现先快后慢的现象。菌丝在培养至第32天时，PDA培养基与PDA加富培养基上的菌丝率先长至培养皿边缘，而改良PDA培养基上菌丝生长略慢，也已接近培养皿边缘，但整体生长速度无显著差异。通过菌丝干质量比较，改良PDA培养基上的菌丝干质量最大为0.19±0.03g，而PDA培养基与PDA加富培养基上的菌丝干质量分别为0.1±0.01g和0.11±0.003g，综上实验数据分析，说明改良PDA培养基上的菌丝干质量积累较多，确定改良PDA培养基为蒙古口蘑菌种的最优固体培养基配方。马荣山等[11]对蒙古口蘑菌盖、菌柄、菌褶以及菌盖和菌柄交界处，取采用组织分离法分离菌丝体进行分离培养，结果表明在菌丝萌发后30～36d后，4种组织分离的菌丝均长满试管，萌发率约为35%。本研究采用与马荣山相近的固体培养基配方的基础上进行改良，最终改良PDA培养基上蒙古口蘑菌丝的长势和所需生长时间与其基本相近。

图3 蒙古口蘑菌种在3种固体培养基上的菌丝长度

2.3 蒙古口蘑菌种液体培养基的筛选结果

选用常见的4种液体培养基进行菌种培养，结果见图5，并以菌丝体生物量(折线图)和菌丝球平均长度(柱状图)为评价指标，对蒙古口蘑最佳液体培养基进行筛选，结果见图6。由图6可知，蒙古口蘑菌种在液体培养基A、B、C、D上的菌丝生物量分别为3.71±0.15g·L-1、6.19±0.12g·L-1、4.01±0.10g·L-1、2.33±0.11g·L-1，其中液体培养基B上菌丝生物量最大；4种液体培养基中菌丝球平均长度分别为4.5±0.3cm、4.77±0.35cm、3.73±0.15cm、2.7±0.1cm，在液体培养基B上的菌丝球平均长度最高。通过菌丝体生物量及菌丝球平均长度的比较分析，最终确定液体培养基B为蒙古口蘑菌种的最佳培养基配方。其他学者也对蒙古口蘑液体发酵进行了深入研究。渠志臻[13]通过优化接种量、装液量、摇床转速等蒙古口蘑液体摇瓶培养参数，最终测得培养13d后，菌丝体生物量增长到10.6g·L-1。张娟等[15]对巴音布鲁克草原上分布的野生蒙古口蘑液体培养基的天然营养物质和培养条件进行优化，培养10～15d后，其菌丝生物量可达6.848g·L-1。本研究初步筛选的液体培养基配方B，接种量远小于以上研究报道，并在培养5d后，其生物量就与张娟等研究报道的生物量相近，可见本研究筛选的液体培养基B相较具有一定优势。

2.4 蒙古口蘑菌种栽培种培养基的筛选结果

选用3种栽培种培养基对蒙古口蘑菌种进行培养，观察记录菌丝在栽培种培养基上的生长状态，结果见图7，并通过菌丝平均吃料深度筛选出最适合该种蒙古口蘑菌种生长的栽培种培养基配方，结果见图8。经过10d的栽培培养，以玉米为主料的栽培种培养基平均吃料深度为10.2±0.53cm；以高粱为主料的栽培种培养基平均吃料深度为11.36±0.72cm，并率先长满栽培瓶；以小麦为主料的栽培种培养基平均吃料深度为8.66±0.26cm。综合以上实验数据显示，以高粱为主料的栽培种培养基吃料深度最深，且菌丝茂密，生长状态良好，由此确定高粱为主料是蒙古口蘑菌种的最优栽培种培养基配方。鲁铁[3]对玉米粒、麦粒、大米、羊草、发酵羊草5种基质进行了蒙古口蘑固态发酵的最佳基质的筛选，最终以满瓶生长时间(32d)和成本确定玉米粒为较优良的固态发酵基质。本研究以率先长满栽培瓶的时间和菌丝吃料深度完善了筛选评价条件，并且菌丝生长时间和长势明显优于鲁铁研究报道的玉米粒固态发酵基质。

图6 4种液体培养基上的菌丝体生物量和菌丝球平均长度

图7 蒙古口蘑菌种在3种栽培种培养基中的生长状态

图8 蒙古口蘑菌种在3种栽培种培养基中的吃料深度

3 结论

本文通过菌种分子鉴定、固体培养基、液体培养基、栽培种培养基的筛选研究确定改良PDA培养基为蒙古口蘑菌种的最佳固体培养基配方，在培养32d后，菌丝干质量达0.19±0.03g；确定液体培养基B为蒙古口蘑菌种的最佳液体培养基配方，在培养5d后，菌丝体生物量与菌丝生长长度分别为6.19g·L-1、2.7±0.1cm；确定以高粱为主料的栽培种培养基为蒙古口蘑菌种的最佳栽培种培养基配方，培养10d后，其菌丝吃料深度为11.36±0.72cm。本研究最终选用固体、液体、栽培种3种培养基成分来源广泛、配制方便、价格便宜，通过对蒙古口蘑菌种进行改良，适用于大规模的推广和应用。以3种培养基培养的优质菌种为进一步保护和开发锡林郭勒草原白蘑提供科学基础。