奶山羊布鲁氏菌病抗原与抗体双检测的效果分析

董丽娟,杨少华,王 广,沙日阿康,屈颖新,任新阳,党彬州,李 广,*

(1.陕西陇县畜牧工作站,陕西 陇县 721200;2.陇县兽医工作站;3.西北农林科技大学动物科技学院;4.陇县固关镇畜牧兽医站)

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患疾病,被列为人类和动物的第二类感染。家畜中牛、羊等动物流动性较其它动物强,临床特征是主要侵害家畜的生殖系统。对母畜来说,该病的潜伏期为14～180 d,母畜最显著的症状是流产,发生时间不固定,常发生于第六到第八个月,大多数在第一次流产后则不再流产,公畜则多出现睾丸炎,此病严重危害人和动物健康,被OIE列为B类动物疫病。该病在世界各地流行范围十分广泛,在很多国家和地区的家畜中广泛报道,其中100多个国家和地区有人感染布氏杆菌病。我国多年坚持检疫和淘汰扑杀措施,使该病曾一度得到控制,但由于该病传染性强,且养殖人员防护意识较低,防控体系较薄弱,资金方面也是一笔不小的数目,所以当前我国布病防控形势依旧十分严峻。另一个新的流行病学趋势是布鲁氏菌病从牧区向农区蔓延,以点状散发或点状暴发的形式流行。国外的布病检测最早是在1976年Garin-Bastuji等首次用ELISA检测布鲁杆菌抗体,并发现其敏感性比试管凝集反应要高10～100倍,在此基础上,后面的研究者不断地推出新的检测方法和检测工具。近年来,许多地区人畜间布病的发病率也呈现上升趋势。人类是布氏杆菌的终末宿主,可通过喝生乳,吃生肉或半熟的肉感染,或者饮用被病畜污染的水感染,也会通过吸入空气中带有布氏杆菌的尘埃,飞沫而感染,还可以通过创伤的皮肤而感染,从而危害人的健康。因此,加强布病的防控势在必行。为了有效防控布病,必须严格执行国家对该病的防控规定:非疫区通过监测方法;稳定控制区采用监测净化的方法;在控制区和疫区采用监测、扑杀和免疫相结合的防控措施。控制本病传染的最好的办法就是坚持自繁自养,若要引入牛羊,一定要加强检疫,避免引进患病牛羊,如果牛羊已经患有布病,应及时进行淘汰,做好消毒措施。疫苗接种也是预防本病的最有效措施。

随着陕西省奶山羊产业的快速发展,奶山羊引进频率不断增加,引入及外购奶山羊是引起本病传播的主要途径,所以引进羊只时必须加强做好布病检测工作。现行的布病检测还是停留在血清学布鲁氏菌病抗体检上,羊感染了布鲁氏菌病后机体产生抗体后才能检测出羊是否患有布氏菌病,在产生抗体之前着很长一段时间内很难检测出来,但羊已感染布鲁氏菌病,布鲁氏菌病病菌已在羊群中开始转播,待羊产生抗体再检测出阳性个体,羊群中已感染很多,造成重大经济损失。为此,本研究采用布鲁氏菌病抗原与抗体双检测方法对某地奶山羊场进行了检测分析,为奶山羊布鲁氏菌病的净化与防控相关的研究工作提供一定的理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 在陇县选择2家奶山羊养殖户作为试验场,试验用奶山羊514只。

1.1.2 试验试剂 布病抗原、抗体检测卡,由深圳芬德生物技术有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 布鲁氏功病抗原检测卡检测 布病抗原检测卡通过胶体金免疫层析试验(GICA)方法制成,样品加入至加样孔后与胶体金标记物同时沿层析膜下移,若样品中的布病抗原与胶体金标记物和检测线的扑捉物结合从而显示紫红色,若样品中不存在布病抗原,则不产生紫红色反应,布病抗原检测卡主要用于检测血液中的布病抗原。

1.2.2 布鲁氏菌病抗体检测卡检测 布病抗体检测卡利用胶体金免疫试验(GICA)方法制成,样品加入至加样孔后与胶体金标记物同时沿层析膜下移,若样品中布病抗体与胶体金标记物和检测线的抗原结合从而显示紫红色,若样品中不存在布病抗体,则不产生紫红色反应。布病抗体检测卡主要用于检测血清中的布病抗体。

1.3 数据分析方法

统计分析结果采用“平均数±标准差”来表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,具有统计学意义。

2 布鲁氏菌病检测结果与分析

2010年陕西某养羊场在引入羊只时不慎将布鲁氏菌病羊引入,利用抗体单一布病检测法发检测了全群228只羊已感染36只,阳性率为15.79%,并对感染羊只进行了无害化处理,羊场紧急进行了清洗消毒;同时为了有效控制疫病的传播,3个月后对剩余的192只羊有进行了一次全群检测,结果检测出18只阳性羊,阳性率为9.38%,同样又在6个月后对剩余的174只羊采用抗原与抗体双检测方法,布病抗体单一检测法检出8只阳性羊,阳性率为4.60%,同样的进行进化消毒;布病抗原检测卡检测检测出10只羊,而且用布病抗体检测卡和布病抗原检测卡检测出来的羊只编号完全不同,随将18只羊全部进行了无害化处理,6个月后对剩余的156只羊进行布病抗原与抗体双检检测,结果仅检查出1只阳性羊,阳性率为0.64%;6个月后对剩余的155只羊进行同样的方法进行检测,未发现布病阳性羊;继续在3个月、6个月进行检测,均未发现阳性羊。某奶山羊场布病抗体单一检测法和抗原与抗体双检测分析结果见表1。

表1 某奶山羊场布抗体单一检测法与抗原与抗体双检测分析结果 只,%

3 布鲁氏菌病检测讨论

世卫组织和联合国粮农组织已经宣布布病是易被忽视的人畜共患疾病之一,全球100多个国家每年约有50多万新发布病病例。布鲁氏杆菌病一直是我国存在的持续性的人畜共患病之一,也是各地养殖场区突出的公共卫生问题,常年来对牛羊的生长和繁育工作造成了很大的困扰。通过本次试验结果显示,对引进的羊只使用不同方法的布病检测,初次检测的羊中使用双抗结合使用检测的阳性率更低为10.36%,比单一使用的检测法低了5.45%,说明后者使用效果显著;同样的方法,在3个月后再次对剩余的健康羊群做布病检测,结果发现使用双抗检测法阳性检出率降低明显占健康羊只的0.64%,较抗体单一检测法减少了8.74%,说明使用双抗结合法检测能对羊群起到较好的的检测效果;然后在6个月后对第二次健康的羊只进行布病检测发现抗体单一检测法检出了8只羊,占全群健康羊只的4.60%,而使用双抗结合的检测方法没有检出阳性羊只,充分说明了使用双抗检测布病法优于抗体单一检测法,达到了预期净化羊群的目的。羊的布病感染的因素是多方面的,进入21世纪以来,随着我国人民生活水平的不断提高,奶羊产业逐渐繁荣起来,便捷的交通使人们可以随处流动,从而导致布病的发病率也随着持续升高。有研究表明,自2004年以来,布鲁氏菌病的牲畜阳性率和感染人的数量明显的升高,2014年达到峰值为57 222。也有大量的研究发现,羊的布病感染率强于牛的。动物感染布病的途径主要是由于接触感染布氏杆菌的家畜、细菌排泄物或食用被该菌污染的食物,尤其是绵羊和山羊奶制品。Zurong Y等人的研究表明,气温、日照时间、降雨量、相对湿度等在人间布氏杆菌病传播的季节波动中起着至关重要的作用。人感染本病主要表现为发热,呈长期低热状态或呈波形热等,急性期患者多汗,最常见症状是全身无力,食欲不振类似于感冒,也会伴随关节炎和生育等问题的出现。布鲁氏菌 SAT 是目前诊断布病的确诊证据之一,但不同实验室检测结果相差较大。

现阶段,我国常用的布氏杆菌检测的方法有3种:首先是细菌分离鉴定方法,它是布病诊断的“金标准”,但由于布病的分离培养时间长、检出率低、检测条件高,对试验技术人员的危害较大,存在一定的生物安全隐患。其次是血清学检测方法,当大规模检测布病时,血清学检测是诊断布氏杆菌病的常用方法,其敏感性较差、易受到非特异性抗体干扰,易发生溶血、误差大且操作较为繁琐,易受肉眼观察的主观因素的影响等缺点,且存在假阳性和假阴性,确诊还需要结合其他检测方法。最后是分子生物学检测方法,随着分子检测技术的发展,PCR技术成为一种快速简便、纯度要求低、特异性强、灵敏度高的体外核酸扩增技术方法,被广泛应用于动物学、生物学、食品卫生等领域。但也存在一些假阴性、假阳性等问题,同时其缺乏规范化的检测方法和判定标准。定量PCR易污染、实验成本和实验场所要求较高,限制了其推广和临床应用,还需进一步的优化提升其检测的稳定性和实用性。

4 布鲁氏菌病检测结论

综上所述,在本次试验条件下,使用单一抗原检测发现假阴性率较高,检测的周期也较长,而使用布病抗原检测卡和布病抗体检测卡两者有机的结合的方法,检测出的假阳性率较低,能在较短生长周期内净化羊群,因此,使用后一种方法能较快检出阳性率达到有效净化奶山羊群体的目的,进而对提高奶山羊养殖经济效益和全群羊只健康指数具有重要意义。