穴位埋线通过PD-1／OX40 信号通路影响类风湿关节炎的炎症水平

陈丽川，段 波，喻 昭，马志毅，孟倩文

（武汉市中医医院 风湿病科针灸科，武汉 430050）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）作为一种常见的炎症性关节炎，主要表现为关节疼痛和僵硬，伴随终生的发病率在世界范围内高达1%［1］，其诊断标准包括至少一个关节有明确的肿胀［2］。 RA的主要特征是炎症途径导致的关节滑膜细胞增殖，形成的血管翳可能导致软骨的破坏和骨质的侵蚀，促炎因子大量产生更加促进了这一过程的发生［3］。在RA 患者治疗中，两种或两种以上的抗风湿药物联合治疗比单药治疗更有效，但是两种以上的生物制剂的使用会带来很大的不良反应风险。

穴位埋线（acupoint catgut embedding，ACE）是现代针灸的一种，是指用无菌镊子将肠线（1.0 ～1.5 cm）放入一次性无菌针的针尖，肠线与针尖内缘平行，针头随针用钝针，将消毒过的针头插入消毒过的穴位，将针刺针推入片刻，取出无菌针，将肠线留在穴位［4－5］。 穴位埋线结合了针灸和穴位的优点，对穴位和机体产生全面持久的作用，此方法价格低廉，疗效持久，临床上被广泛应用。 研究证明，在与炎症反应有关的急性呼吸窘迫综合征研究中，通过穴位埋线治疗降低了白细胞介素－6（interleukin 6，IL-6）水平，抑制了促炎细胞因子的产生［6］。 Lu等［7］总结发现，在治疗以肠道炎症为主的溃疡性结肠炎疾病中，通过穴位埋线治疗效果更持久，愈合所需时间更短。 目前也有很多研究通过穴位埋线能够有效治疗RA，但是对其机制研究尚不明确。

此外，程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）信号缺失或被阻断可以导致一系列自身免疫性疾病，而肿瘤坏死因子受体超家族成员4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4，OX40）信号敲除或被阻断则对自身免疫性疾病有治疗作用。 PD-1 和OX40 共刺激信号失衡可促进RA 疾病的进展［8］。 因此，本研究通过建立RA 模型大鼠，对大鼠穴位埋线和给药治疗，从炎症因子、滑膜形态以及流式检测PD-1／OX40 及分化决定族抗原4（CD4）／T 细胞特异性表面糖蛋白（CD28）细胞含量方面，进一步探讨穴位埋线在RA 中可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD 大鼠，SPF 级，雌性，8 周龄，体重150 ～180 g，共25 只，来源于三峡大学［SCXK（鄂）2022－0012］，在武汉华联科生物技术有限公司无特定病原体（specific pathogen free，SPF）条件下饲养［SYXK（鄂）2018－0104］。 所有动物实验均由华联科生物技术有限公司伦理委员会审批（HLK-20200110-001）。 实验过程严格按照3R 原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

来氟米特（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，L129518）；戊巴比妥钠和完全弗氏佐剂（美国sigma 公司，P3761、F5881）；IL-6 和白细胞介素－8（interleukin 8，IL-8）ELISA 试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司，RA20607）；二甲苯（北京沃凯生物科技有限公司，40091060）；苏木素和伊红（北京碧云天生物科技有限公司，C0107 和C0109）；大鼠全血单个核细胞分离液KIT（上海微科生物技术有限公司，LDS1080）；所有抗体PD1（PAB47902）、OX40（PAB47968）、 GAPDH （PAB36269） 和Goat anti-Rabbit IgG（SAB43714）均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。 可吸收缝合线（上海浦东金环医疗，66V1228A）；埋线针（高冠医械，20162271059）；酶标仪（芬兰雷勃，MK3）；电泳仪（Bio-Rad，mini protean 3 cell）；全自动化学发光分析仪（上海天能，Tanon-5200）；流式细胞仪（艾森，NovoCyte）；倒置荧光显微镜（Leica 公司，MIL LED）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

将动物按照随机数字表（由SPSS17.0 程序生成）随机分为5 组，每组5 只。 对照（control）组：造模后第10 天开始予以等剂量生理盐水灌胃，连续42 d。 模型（model）组：造模后第10 天开始予以等剂量 生 理 盐 水 灌 胃， 连 续 42 d。 来 氟 米 特（Leflunomide）组：造模后第10 天开始予以大鼠灌胃来氟米特量为10 mg／（kg·d），灌胃剂量1 mL／100 g，连续42 d。 穴位埋线（acupoint catgut embedding，ACE）组：按照上述造模过程，造模后第10 天进行穴位埋线，处理42 d，埋线3 次。 穴位埋线＋来氟米特（ACE＋Leflunomide）组：造模后第10 天开始予以大鼠灌胃来氟米特量为10 mg／（kg·d），灌胃剂量1 mL／100 g，连续42 d，并进行上述穴位埋线操作。

将各组大鼠右后足趾皮下注射完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）0.1 mL 致炎。 其中对照组按照造模过程注射等量PBS。

1.3.3 穴位埋线

实验前动物禁食不禁饮12 h。 以3%戊巴比妥钠麻醉大鼠。 背部、右后腿剃毛后消毒备用。 参照文献进行穴位埋线［9］，定位双侧“足三里”“肾腧”。“肾腧”位于第二腰椎下两旁，左右各一穴，“足三里”位于膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm 处。将大鼠俯卧位固定，将9 号针头（含0.8 cm 长无菌羊肠线），刺入已消毒的双侧“足三里”和“肾腧”，将肠线完全置入穴内。 操作完成后使用碘伏消毒创面。

1.3.4 取材

用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，取抗凝新鲜全血用于细胞流式检测；血清用于ELISA 检测；滑膜组织用于病理HE 染色。

1.3.5 关节炎指数

参照前期方法［9］，每7 d 对大鼠进行关节炎评分。 其标准见表1。

刘芒也是顽固的排外派，认为大量的外来人口让人看着就很讨厌，把他们原来的家园搞的乱七八糟，所以他制定了一个规矩，只要是当地人凭借一口当地话去那里吃饭就可以打五折，刘芒的老婆却是个包容派，她认为本来就没有什么永远的家园，那都只是人类迁徙过程里的落脚处，只是落脚的时间长短不一而已，她为了让外地人更好的融入这里，开了一个收费培训班，专门培训外地人说当地话。他们这样一个组合真是非常奇怪，实在是无法计算他们的家庭总收入到底会多一点呢还是少一点。

表1 关节炎评分标准Table 1 Arthritis scoring standard

1.3.6 炎症因子检测

采用ELISA 试剂盒测定大鼠血清中的IL-6 和IL-8 水平，其测定步骤严格按照按照试剂盒说明书进行，通过标准品的稀释，加样，加酶及温育，洗涤，显色，最终加入终止液，在450 nm 波长依序测量各孔的吸光度，计算IL-6 和IL-8 的浓度。

1.3.7 滑膜组织病理检测

将样本经过脱钙、浸蜡及包埋、切片（3 μm）、烤片后进行HE 染色，并采集样本相关部位。 根据炎症滑膜中的三大类细胞群（定居细胞群、迁移细胞群和内膜细胞群）对HE 染色进行定量评分［10］。 评分范围依次为0 分（正常）、1 分（轻度）、2 分（中度）、3 分（重度）。 将3 种炎症特征的参数进行汇总，总分0～1 分表示正常，炎症级别为0；总分2 ～3分为轻度滑膜炎，炎症级别为1；总分4～6 为中度滑膜炎，炎症级别为2；总分7 ～9 分为重度滑膜炎，炎症级别为3。

1.3.8 流式检测

分离大鼠外周血单个核细胞进行流式检测。取各组样本，1×106个细胞，100 μL PBS 重悬后，每管加入2 μL OX40-APC、CD4-PerCP-eFluor 710 和CD28-PE 抗体，4℃避光孵育30 min；加入2 mL PBS洗涤1 次，4℃400 r／min，离心5 min，弃上清液；加入1 mL 4%多聚甲醛室温固定30 min；用1 mL PBS洗2 次，每次3 min，弃去PBS；加入200 μL 用PBS 1 ∶200 稀释后的抗体PD-1，室温孵育1 h，用1 mLPBS 洗2 次，每次5 min，弃去PBS；加二抗稀释液：加入200 μL 用PBS 1 ∶200 稀释后的二抗，37℃，孵育1 h；用1 mL PBS 洗2 次，每次5 min，弃去PBS；400 μL 的PBS 重悬细胞，4℃避光保存，上机检测，使用NovoCyte 分析软件分析实验结果。

1.3.9 Western blot

取各组样本，采用蛋白抽提试剂盒提取不同组别细胞总蛋白。 采用BCA 法测定蛋白浓度。 采用SDS-PAGE 电泳分离总蛋白，每道孔上样50 μg 总蛋白质。 电泳2 h 后，采用湿法转膜至PVDF 膜，将膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，4℃孵育一抗PD1（1 ∶1000）、OX40（1 ∶1000）过夜，次晨采用TBST 漂洗膜，加入HRP 标记的二抗Goat anti-Rabbit IgG（1 ∶20 000），37℃孵育1 h，ECL 显影，保存图像，采用Quantity One 侧光密度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料采用平均数±标准差（±s）表示。 多组间比较使用单因素方差分析，两组间比较采用LSD 检验。 以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 模型鉴定

对照组大鼠的足均正常（图1），跖骨和足骨形态规则，而模型组大鼠右后足出现明显红肿，炎症严重，跖骨和足骨出现多处红斑，足趾明显肿胀，大鼠行走受限。 此模型构建成功。

图1 大鼠模型的鉴定Figure 1 Identification of rat model

2.2 关节炎指数

在大鼠免疫后每7 d 进行1 次关节炎评分，结果如图2 所示，在第7 天除对照组外，各组大鼠踝关节至跖骨处或掌关节出现红斑和中度肿胀，在第14天时除对照组外，各组大鼠炎症加重，炎症因子评分均在3 分以上，在14 d 以后模型组评分没有明显的变化，但是来氟米特组、穴位埋线组和穴位埋线＋来氟米特组炎症因子评分开始下降。 在第49 天时，与对照组比较，模型组炎症因子评分显著升高；与模型组比较，来氟米特组、穴位埋线组和穴位埋线＋来氟米特组炎症因子评分明显下降，且穴位埋线＋来氟米特组最低。

注：与对照组相比， ＃＃P＜0.01；与模型组相比， **P＜0.01。图2 各组关节炎指数Note.Compared with control group， ＃＃P ＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 2 Arthritis index of each group

2.3 血清中炎症因子水平

模型组与对照组比较（图3），大鼠血清中IL-6、IL-8 含量均显著升高（P＜0.01）。 与模型组比较，来氟米特组、穴位埋线组和穴位埋线＋来氟米特组大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量均显著下降（P＜0.01）。

注：与对照组相比， ＃＃P＜0.01；与模型组相比， **P＜0.01。图3 各组大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 3 Contents of IL-6 and IL-8 in serum of rats in each group

2.4 组织病理形态观察

对大鼠滑膜组织进行HE 染色（图4），结果发现，对照组大鼠的关节滑膜组织结构和形态正常，模型组大鼠滑膜组织遭到破坏，有大量的炎症细胞浸润，血管扩张，纤维细胞增生，在进行来氟米特和穴位埋线处理后大鼠滑膜组织中炎症细胞浸润明显降低，血管增生被抑制，且在来氟米特和穴位埋线共同作用时效果最明显。 此外，与对照比较，模型组评分显著升高（P＜0.01）。 与模型组比较，来氟米特组、穴位埋线组和穴位埋线＋来氟米特组评分显著降低（P＜0.01）。

注：与对照组相比， ＃＃P＜0.01；与模型组相比， **P＜0.01。图4 大鼠滑膜组织HE 染色Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 4 HE staining of rat synovium

2.5 流式检测

流式检测的大鼠血中PD-1／OX40 及CD4／CD28 细胞含量（图5），与对照组比较，模型组中大鼠的PD-1 和CD4／CD28 细胞含量显著增加（P＜0.01），OX40 显著降低（P＜0.01）。 与模型组比较，穴位埋线组和穴位埋线＋来氟米特组的PD-1 和CD4／CD28 细胞含量显著降低（P＜0.01），OX40 显著增加（P＜0.05）。 如图6 所示，通过Western blot检测相关通路的变化，与对照组比较，模型组PD-1的蛋白表达显著上调（P＜0.01），OX40 的蛋白表达显著下调（P＜0.01）。 与模型组比较，来氟米特组、穴位埋线组和穴位埋线＋来氟米特组PD-1 的蛋白表达显著下调（P＜0.01），OX40 的蛋白表达显著上调（P＜0.01）。

注：与对照组相比， ＃＃P＜0.01；与模型组相比， *P＜0.05，**P＜0.01。图5 流式检测PD-1／OX40 及CD4／CD28 细胞含量Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， *P＜0.05，**P＜0.01.Figure 5 Flow cytometry detection of PD-1／OX40 and CD4／CD28 cell

注：与对照组相比， ＃＃P＜0.01；与模型组相比， **P＜0.01。图6 通过Western blot 检测PD-1 和OX40 的蛋白表达Note.Compared with control group， ＃＃P＜0.01.Compared with model group， **P＜0.01.Figure 6 Detection of protein expression of PD-1 and OX40 by Western blot

3 讨论

RA 是一种慢性的炎症性关节疾病，可导致不可逆的关节损伤和严重残疾，在过去的几年里，在RA 治疗方面已经取得了很大的进展，但其治疗机制尚不明确［11］。 而且，仍有一部分的患者对这些治疗并没有得到有效的反应。 基于目前对穴位埋线的研究发现，穴位埋线不仅能够有效治疗多种疾病，而且还弥补了传统针灸治疗周期长和刺激时间短的缺点［12－14］。 李小兰等［15］研究发现，通过穴位埋线联合西药治疗类风湿关节炎，结果实现其治疗效果显著改善。 本研究中，通过对大鼠的关节炎评分发现，穴位埋线和来氟米特治疗后，大鼠的关节炎指数明显降低。 在RA 发病机制中，活化的T 细胞产生炎性细胞因子刺激巨噬细胞和单核细胞。本研究中，在RA 治疗中通过穴位埋线能够显著降低大鼠血清中IL-6、IL-8 的含量，缓解了大鼠关节炎症，通过HE 染色观察滑膜组织发现，在穴位埋线后大鼠滑膜关节的损伤明显的得到缓解。

程序性死亡受体1（PD-1），是一种重要的免疫抑制分子，负责T 细胞的激活增殖和细胞毒性的分泌［16］。 在慢性感染期间，PD-1 由于失去甲基化启动子而在耗尽的CD8 细胞中表达［17］。 在一项研究中表明，与健康者比较，三名HL 患者肿瘤浸润性T细胞中的PD-1 水平显著升高［18］。 PD-1 能够向下调节免疫系统对人体细胞的反应，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统。 OX40 是一种有效的共刺激受体，能够增强T 淋巴细胞表面的T 细胞受体信号，是能被特异性识别的信号［19］，其主要由T 细胞表达，并在CD4＋T 细胞上的表达较高［20］，能够增强T 细胞对效应分子和细胞因子的增殖和表达，对促炎细胞因子的产生有明显的抑制作用。

之前有研究证明，PD-1 的缺失或阻断可导致自身免疫性疾病［21］，而OX40 信号对自身免疫性疾病具有治疗作用［22］。 Ma 等［23］发现，具有高水平的OX40 和低水平的PD-1 会使晚期胰腺导管腺癌患者具有更长的生存时间。 本研究中，在穴位埋线和给予来氟米特后OX40 的含量显著增加，CD4＋CD28＋和PD-1 细胞含量显著下降；而RA 模型组中OX40＋的含量最低，CD4＋CD28＋和PD-1 细胞含量较高。 我们推测这是在RA 病理中可能存在PD-1 和OX40 共刺激信号的不平衡，使CD4＋T 细胞异常激活，从而导致自身免疫。 共刺激分子PD-1 和OX40分别属于免疫球蛋白家族和TNF 家族，均在CD4＋T细胞的激活直接具有重要的作用，其异常信号与多种自身免疫性疾病有关［9］。

综上所述，本研究采用CFA 诱导构建RA 模型，通过实验进行穴位埋线和来氟米特治疗后，能够明显降低RA 的炎症程度，其作用机制可能与调控PD-1／OX40 信号通路有关。