优化稳定剂提高丙酮酸氧化酶稳定性的研究

刘 冰,丛文杰,姚兵莉,周化岚,张建国

(上海理工大学 健康科学与工程学院 食品科学与工程研究所,上海 200093)

稳定性是酶成功应用的关键因素[10],特别是对于多亚基丙酮酸氧化酶,提升其稳定性更为必要。目前,提高多亚基酶稳定性的方法有基因突变、化学修饰、介质工程和固定化等[11]。通过添加稳定剂的介质工程方法具有操作简便、可靠性好的优点[12],多数商业酶利用该方法储存。化学稳定剂主要有多元醇、糖类和无机盐等,分别具有增强疏水作用和二价阳离子的离子效应[12]。然而,稳定剂对酶的作用具有特异性,因此需要根据不同酶来选择合适的稳定剂。如,葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和环糊精糖基转移酶的稳定性分别通过添加乙二醇壳聚糖[13]、多羟基化合物[14]和复合稳定剂[15]而显著提高。

本研究首先考察丙酮酸氧化酶在不同pH、环境温度条件下的性质,接着通过复配甘油和PEG2000对丙酮酸氧化酶的活性和稳定性进行研究,最后将优化后的复合稳定剂用于纯丙酮酸氧化酶的储存,以期达到长期储存丙酮酸氧化酶的目的。

1 材料与方法

1.1 丙酮酸氧化酶的制备

所用的分析纯化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

粗提丙酮酸氧化酶溶液(酶活1 725.16 U/L、蛋白质115.44 mg/L)由重组大肠杆菌[7]发酵制备。具体步骤如下:20 mL重组大肠杆菌pET28a-pod细胞在12 000g和4 ℃下离心3 min,然后加入20 mL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 6.8),于冰浴中以135 W功率、φ2.0 mm 直径探头进行超声破碎(JY92-IIDN型,宁波新芝生物技术有限公司),每个循环破碎4 s、间隔6 s,共持续3 min。随后破碎液在12 000g和4 ℃下离心5 min,取上清液作为粗提丙酮酸氧化酶溶液。

纯丙酮酸氧化酶的制备:首先,1.0 mL纯化介质(Ni-NTA) 琼脂糖柱以12 000g离心1 min,并用0.1 mol/L PBS(pH 6.8) 洗涤2次。接着将5 mL 粗提丙酮酸氧化酶溶液与Ni-NTA在16 ℃下混合1 h,然后以12 000g离心1 min去除上清液。最后,加入10 倍体积的20 mmol/L PBS(pH 6.8)洗涤。而Ni-NTA 琼脂糖柱用含有500 mmol/L咪唑的20 mmol/L PBS (pH 6.8) 洗涤,并通过1 h振荡和12 000g离心1 h的方法获得的丙酮酸氧化酶溶液(236.63 U/L),即为纯丙酮酸氧化酶溶液。

1.2 不同pH对粗提丙酮酸氧化酶的影响

将1 mL 粗提丙酮酸氧化酶溶液与 9 mL 0.1 mol/L PBS(用醋酸钠调节pH至4.0 和5.0,用K3PO4调节pH 至6.0、6.8、7.0、8.0和9.0)混合,初始的酶活设为100%,并在4或20 ℃下储存5 h,每小时测定丙酮酸氧化酶的酶活。

1.3 温度对粗提丙酮酸氧化酶的影响

将1 mL丙酮酸氧化酶溶液与9 mL 0.1 mol/L PBS(pH 6.8)混合,初始酶活设为100%,于不同温度条件下保持5 h,每小时测定丙酮酸氧化酶的酶活。

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1.4 稳定剂对丙酮酸氧化酶稳定性的影响

将稳定剂添加到粗提丙酮酸氧化酶溶液中,将终体积为150 μL的样品于20 ℃下储存2 h,以未添加稳定剂的丙酮酸氧化酶酶活作为初始酶活(100%)。表1为含有0.01 mmol/L CuSO4的甘油和PEG2000作为复合稳定剂的组成。

表1 甘油和PEG2000混合物的浓度梯度

1.5 复合稳定剂对纯丙酮酸氧化酶性质的影响

1)热稳定性。将含有优化后稳定剂的1 mL丙酮酸氧化酶溶液置于不同温度下储存5 h,每小时测定丙酮酸氧化酶的酶活,以未添加稳定剂且未保温的纯丙酮酸氧化酶的酶活为100%。

2)pH稳定性。将1 mL纯丙酮酸氧化酶溶液与 9 mL不同pH的PBS(用0.1 mmol/L醋酸钠调节pH至 4.0和5.0,用0.1 mmol/L PBS调节pH至 6.0、6.8、7.0、8.0和9.0)混合,分别置于20 ℃保持5 h,每隔1小时测定丙酮酸氧化酶的酶活,以未保温的纯丙酮酸氧化酶的酶活为100%。

3)保藏稳定性。将1 mL纯丙酮酸氧化酶溶液与9 mL 0.1 mol/L PBS(pH 6.0)混合,分别置于不同温度(4、20、25和30 ℃)中保持5 h,每小时测定酶活。以未保温的纯丙酮酸氧化酶初始酶活设为100%。

1.6 稳定剂对纯丙酮酸氧化酶储存稳定性的影响

添加复合稳定剂的丙酮酸氧化酶溶液(0.1 mol/L PBS,pH 6.0)分别在-20、4和20 ℃下储存。以未添加稳定剂的纯丙酮酸氧化酶的酶活为100%。

1.7 丙酮酸氧化酶酶活的测定

将100 μL丙酮酸氧化酶溶液与1.0 mL反应液混合,反应液含有0.1 mol/L丙酮酸钠、0.015 mol/L MgCl2、9 g/L苯酚、1.5 mmol/L 4-氨基安替比林、0.1 mol/L PBS (pH 6.8)、0.1 mmol/L黄素腺嘌呤二核苷酸、1.0 mmol/L焦磷酸硫胺素和50 U/mL辣根过氧化物酶,于37 ℃孵育10 min。随后,使用酶标仪(LMR-340M型,Labexim International公司)在510 nm处测定吸光度A510。丙酮酸氧化酶的酶活定义:37 ℃、pH 6.8条件下,每分钟生成的1 μmol的H2O2所需要的酶量为1个酶活单位(U)。

1.8 动力学参数测定

将丙酮酸氧化酶置于37 ℃水浴中,每隔1 h取出一定量样品测定酶活,重复测定3次,取平均值后计算酶的残留酶活。丙酮酸与氧化酶失活速率常数(Kd)以酶的残留酶活的自然对数为纵坐标,时间t为横坐标,通过对数据点的线性拟合获得,其酶的失活半衰期(t1/2)按式(1)计算而得到。

(1)

在37 ℃和pH 6.8条件下,丙酮酸氧化酶和不同浓度的丙酮酸钠(0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0、2.5、3.5和4.0 mol/L) 在 0.1 mol/L PBS 中反应,测定丙酮酸氧化酶的酶活,利用米氏方程计算重组丙酮酸氧化酶的最大反应速率(Vmax)。

2 结果与讨论

2.1 pH和温度对粗丙酮酸氧化酶稳定性的影响

考察pH和温度对丙酮酸氧化酶稳定性的影响,结果见图1。由图1可知:粗丙酮酸氧化酶的酶活在pH 6.0时最高,在 pH 6.8、7.0、8.0、9.0、5.0和4.0时的相对酶活分别为对照的86.3%、82.8%、81.0%、60.0%、46.7%和9.9%。随着时间的延长,丙酮酸氧化酶的酶活在pH 6.0、6.8和7.0时缓慢下降,5 h后,相对酶活分别降至81.1%、60.8%和59.8%。在pH 5.0、8.0和9.0条件下,丙酮酸氧化酶储存1 h后相对酶活显著降至29.6%、45.3%和24.6%,5 h后相对酶活分别降至13.9%、32.1%和17.7%。而当pH 4.0时,丙酮酸氧化酶的酶活在4 h内稳定为8%～9%,但在5 h时完全失去酶活。

图1 pH和温度对丙酮酸氧化酶酶活的影响

在4～60 ℃范围内,丙酮酸氧化酶的酶活均随时间延长而下降。当丙酮酸氧化酶在4 ℃条件下储存5 h后,相对酶活缓慢降至 69.7%;在20、25和40 ℃下储存5 h后,丙酮酸氧化酶的相对酶活分别降至28.8%、15.4%和0。在37 ℃下储存3 h以及在40、50和60 ℃储存2 h后,丙酮酸氧化酶均完全失去酶活。尽管绿色气球菌的丙酮酸氧化酶的酶活在4 ℃下可以稳定保持数小时,但相对来说,总体酶活较低。

表2和表3为丙酮酸氧化酶在不同pH和温度下的失活速率常数和半衰期。由表2和3可知:丙酮酸氧化酶在pH 6.0时有最小的失活速率常数和最大的半衰期;丙酮酸氧化酶的失活速率常数随着温度升高而增大,半衰期随着温度升高而降低。丙酮酸氧化酶的不稳定性主要归因于其四聚体结构[16]。丙酮酸氧化酶在酸性和碱性条件下,稳定性急剧下降可能是由于其亚基的解离[17]。因此,采用稳定剂有助于提高丙酮酸氧化酶的稳定性,有利于丙酮酸氧化酶的储存。

表2 不同pH下丙酮酸氧化酶的半衰期

表3 不同温度下丙酮酸氧化酶的半衰期

2.2 稳定剂对粗提丙酮酸氧化酶稳定性的影响

为了提高丙酮酸氧化酶的稳定性,考察多元醇类、大分子有机物类、糖类和金属离子这4类稳定剂对丙酮酸氧化酶稳定性的影响,结果见图2。由图2可知:对照组的丙酮酸氧化酶储存5 h后相对酶活约为40%,添加的异丙醇对丙酮酸氧化酶的酶活具有抑制作用;而添加10～500 g/L的其他6种多元醇后,丙酮酸氧化酶的酶活随多元醇添加量呈钟形分布。当添加200 g/L乙醇、200 g/L乙二醇、300 g/L甘油、300 g/L山梨醇、200 g/L PEG400和300 g/L PEG2000时,丙酮酸氧化酶的相对酶活分别为71.2%、82.1%、103.3%、94.8%、74.2%和114.4%,分别是对照组的1.5、1.9、2.6、2.3、1.7和2.6倍。

图2 稳定剂加量对粗提丙酮酸氧化酶稳定性的影响

添加0.5～8 g/L明胶和果胶均对丙酮酸氧化酶的酶活有抑制作用。

添加海藻糖、葡萄糖、蔗糖和鼠李糖后发现,只有鼠李糖对丙酮酸氧化酶稳定性有提高作用。当添加5 g/L鼠李糖时,丙酮酸氧化酶酶活为对照组的1.1倍。

添加不同金属离子后发现,与对照组相比,MnSO4和ZnCl2对丙酮酸氧化酶酶活有抑制作用;(NH4)2SO4对丙酮酸氧化酶酶活的影响不显著;而金属离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe2+对丙酮酸氧化酶稳定性都具有一定的提高作用,且丙酮酸氧化酶的相对酶活随金属离子添加量呈钟形分布。当分别添加0.03 mmol/L NaCl、0.03 mmol/L KCl、0.1 mmol/L CaCl2、0.03 mmol/L MgSO4、0.01 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L FeSO4时,丙酮酸氧化酶的相对酶活分别为初始酶活的56.4%、52.3%、52.8%、38.2%、72.7%和42.0%,是对照组的1.3、1.5、1.1、1.2、1.7和1.3倍,其中添加0.01 mmol/L CuSO4时,丙酮酸氧化酶的稳定性最佳,与Lu等[9]的研究结果相一致。

由于金属离子和多元醇稳定酶活的作用机制并不相同,因此将0.01 mmol/L CuSO4作为储存丙酮酸氧化酶的基础溶液,再进一步优化甘油和PEG2000的配方(表1),结果见图3。由图3可知:丙酮酸氧化酶的相对酶活最终为68.0%～102.9%。添加30 g/L甘油、90 g/L PEG2000的混合物和60 g/L甘油、90 g/L PEG2000的混合物具有相同的效果,但由于30 g/L甘油、90 g/L PEG2000的混合液黏度低于60 g/L甘油与90 g/L PEG2000的混合液,所以选择30 g/L甘油、90 g/L PEG2000的混合液进行下一步实验。最后,使用含有30 g/L甘油和90 g/L PEG2000、0.01 mmol/L CuSO4作为复合稳定剂后,丙酮酸氧化酶在20 ℃储存2 h后的酶活仍为初始酶活的102.9%。

图3 不同甘油和PEG2000添加量对丙酮酸氧化酶稳定性影响结果的等高线

2.3 纯丙酮酸氧化酶特性的表征

考察pH和温度对纯丙酮酸氧化酶稳定性的影响,结果见图4。由图4可知:丙酮酸氧化酶酶活在pH 6.0时始终保持最佳,pH 6.8时次之。随着保存时间的延长,最终分别降至初始酶活的56.2%和12.6%。尽管丙酮酸氧化酶在4和20 ℃储存1 h后的酶活高于它的初始酶活,但总体来说,丙酮酸氧化酶的酶活随着时间的延长呈下降趋势。与粗提丙酮酸氧化酶温度稳定性不同的是,纯丙酮酸氧化酶在20 ℃储存时的酶活高于4 ℃时的酶活。

图4 纯丙酮酸氧化酶的pH稳定性和温度稳定性

2.4 复合稳定剂对纯丙酮酸氧化酶稳定性的影响

在4和20 ℃及不同pH条件下储存5 h后,考察复合稳定剂对纯丙酮酸氧化酶稳定性的影响,结果见图5。由图5可知:当保藏条件为4 ℃、pH为5.0～8.0时,添加复合稳定剂的丙酮酸氧化酶的酶活高于对照组,且在pH 6.0时相对酶活为119.0%,为对照组的1.5倍;当保藏条件为20 ℃、pH 5.0时,复合稳定剂对丙酮酸氧化酶酶活的影响不显著;但当pH为6.0～9.0时,复合稳定剂显著提高了丙酮酸氧化酶的酶活,尤其当pH为6.0时,丙酮酸氧化酶酶活为初始酶活的109.8%。这可能由于添加复合稳定剂增强了丙酮酸氧化酶亚基之间的连接。

图5 复合稳定剂对纯丙酮酸氧化酶稳定性的影响

表4为复合稳定剂对丙酮酸氧化酶的最大反应速率的影响。由表4可知:丙酮酸氧化酶在380.2 mg/L时,最大反应速率增加了91.22%,为最大提高幅度。这表明复合稳定剂在较高浓度的丙酮酸氧化酶中更易形成稳定的立体构象,酶活更稳定[16]。Vmax的升高也证实了添加复合稳定剂使丙酮酸氧化酶亚基更易组合成有酶活的丙酮酸氧化酶。

表4 添加复合稳定剂的丙酮酸氧化酶的最大反应速率

通常,酶在4或-20 ℃下储存以保持较佳的活性,但丙酮酸氧化酶在4 ℃条件下储存20 d后,酶活降至0;虽然在-20 ℃储存7 d后仍保持100%酶活,但在28 d后,酶活降至46.7%(图5(c))。

目前,提高酶稳定性的方法主要有蛋白质改造、固定化和添加稳定剂等,但利用基因工程方法改造丙酮酸氧化酶的研究尚未见报道。刘冰等[18]采用溶胶-凝胶的方法固定化丙酮酸氧化酶,5 h后剩余酶活为66.4%。本研究优化后的复合稳定剂使用方便,28 d后仍剩余46.7%的酶活,可见复合稳定剂的效果较好,且成本较低,有进一步推广的价值。

3 结论

对不同种类稳定剂筛选可知,甘油、PEG2000和CuSO4这3种稳定剂对维持丙酮酸氧化酶酶活有效,而糖类对丙酮酸氧化酶酶活没有显著影响。经过优化后,含有0.01 mmol/L CuSO4、30 g/L甘油和90 g/L PEG2000的复合稳定剂显著提高丙酮酸氧化酶稳定性。含有复合稳定剂的丙酮酸氧化酶在4 ℃下的酶活为对照组的1.5倍。添加复合稳定剂使丙酮酸氧化酶在-20 ℃下储存28 d后仍保持46.7%的酶活,显著提高了丙酮酸氧化酶的储存稳定性,有助于丙酮酸氧化酶的更广泛应用。