超高效液相色谱法测定紫杉醇注射液中的有关物质分析

吴姗娜,卢桂清

(厦门大学附属第一医院,福建 厦门 361000)

紫杉醇是从红豆杉植物中提取出来的,属于抗肿瘤药物,在临床得到广泛应用,用于治疗非小细胞肺癌、子宫内膜癌和膀胱癌等[1-2]。微管蛋白可以与紫杉醇结合,细胞在G2/M期能够进行有丝分裂阻滞,促使肿瘤细胞增殖受到抑制。紫杉醇无法与水相溶,临床紫杉醇抑制剂包含多种类型。通过分析生物样本中紫杉醇的含量,通常采用高效相色谱方法,但是分析灵敏度不高,不同生物样品,特异性存在差异,消耗时间较长[3-4]。如今液相色谱技术发展迅猛,选择性和灵敏度较高,成为检测药物中物质的首选方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择高效液相色谱仪、全自动进样器、高灵敏光纤型紫外检测器(设备来源为Thermo Fisher Scientific公司),乙腈、紫杉醇对照品、无水乙醇(所选物质来源为BASF公司,批号为31163947G0)、纯化水系统、涡旋混合器、四级杆质谱检测器。

1.2 研究方法

1.2.1 配置储备液

精密称定10mg紫杉醇,甲醇溶解,定容到50mL,之后摇匀,得到紫杉醇标准储备液,避光储存,储存温度为4℃。吸取标准储备液,采用浓度为50%的甲醇溶液,进行稀释处理,配置浓度范围为0.05～20μg/m L,稀释到0.1μg/mL、2.5μg/mL、20μg/mL,稀释后的溶液为质控点工作液。

1.2.2 配置内标溶液

称取7.5mg炔诺酮,作为对照品,甲醇溶液,定容到25mL,得到浓度为300μg/mL的炔诺酮内标储备液,避光储存,放置在零下20℃。内标溶液为使用甲醇稀释1000倍的炔诺酮内标储备液(0.3μg/mL)。

1.2.3 配置缓冲液

称取甲酸盐(称取量为1.26g),定容25mL,使用纯水稀释母液,稀释倍数为1000倍,得到缓冲液,缓冲液浓度为0.2mmol/L。各储备液,内标溶液与标准系列溶液以相同体积,应用校正的容量瓶,与移液进行配置,放置在冰箱内,进行避光存储,保存备用。

1.2.4 色谱条件

色谱柱:流动相A为水,B为乙腈 梯度洗脱(5分钟以内浓度为40%,5～11分钟浓度为40%～80%;10～11分钟浓度为80%);检测波长设置为227nm,柱温设置为40℃,流速为每分钟0.6mL。

1.2.5 系统适用性溶液

选取30mg紫杉醇对照品,测定精密,将其放置在25mL量瓶中,添加0.01mol/L氢氧化钾甲醇溶液,溶液为1mL,摇动1分钟后,使用浓度为0.1%的冰醋酸乙醇溶液进行稀释,摇匀处理。

1.2.6 系统适用性溶液

精密称取三种杂质对照品,使用乙醇溶液进行稀释,稀释后的紫杉醇为0.5mg/mL,选择适量杂质,杂质1、杂质2各为 2.5 μg/mL,杂质3为 25μg/mL的溶液。选取无水甲醇溶液和聚氧乙烯35蓖麻油适量,精密称取25mg紫杉醇作为对照品,放置在20mL量瓶中,使用甲醇溶液进行稀释,摇匀处理,称量1mL上述溶液,放置在100mL量瓶中,摇匀处理。

1.2.7 测定色谱条件

强制降解试验法,选取紫杉醇注射液,进行酸、高温、碱降解,制成0.5 mg/mL 的溶液,分别进样。(1)酸破坏试验,添加1.0 mol/L的盐酸,盐酸含量2mL,放置在温度25℃环境中,放置时间为2小时,之后加入1.0mol/L的氢氧化钠2mL中和,使用甲醇定容,摇匀处理。

1.3 观察指标

(1)强制降解试验;(2)分析准确度考核结果;(3)线性分析。

2 结果

2.1 强制降解试验

紫杉醇具有不稳定性,在各种降解条件下,实施降解处理,测定降解杂质不干扰目标,在光照条件下,以及碱条件下,会增加杂质数量和杂质质量,在酸、光照与碱条件下,原料峰值面积会降低90%左右,不同杂质峰之间分离良好。

2.2 分析准确度考核结果

原有量为1.5μg/mL,加入量为0.49μg/mL,则测得量为1.99μg/mL,回收率为99.3%,标准偏差为2.95%。原有量为0.98μg/mL,测得量为2.46μg/mL,回收率为99.3%,标准偏差为2.38%。原有量为1.5μg/mL,加入量为1.45μg/mL,测得量为2.94μg/mL,回收率为99.6%,标准偏差为1.5%。

2.3 线性

波长为225nm,标准偏差为0.89%,杂质个数为5个;温度为38℃,标准偏差为0.89%,杂质个数为5个;流速为0.54ml/min,标准偏差为2.49%,杂质个数为5个;色谱柱为1个,标准偏差为1.79%,杂质个数为5个。

3 讨论

应用超高液相色谱仪,对色谱条件进行优化,促使检测时间缩短[5-6]。由于紫杉醇水溶性较弱,如果使用传统紫杉醇注射液,需要将无水甲醇与聚阳已烯麻油相互混合作为增溶剂[7-8]。在紫杉醇外吸收波长,可以观察到辅助色谱峰。文章设置空白对照溶液,促使机械和辅料的干扰峰得以排除。

进样体积需要得到优化,为促使要点方法的延续性得到保障。文章所选供试品及对照品的溶液,具有相同浓度,色谱柱体积与进样体积之间呈现正比例特点,最后能够计算出进样体积。在实验过程中,可以将进样体积设置为1,促使有关物质的检出率得到保证。

优化梯度洗脱程序,为促使梯度变化不会对分离效果产生影响,需要保持不同规格色谱柱的洗脱体积倍数相同。在药典方法中,有机相比例在20分钟以内,从40%逐渐上升到80%。时间为25分钟,计算出梯度段时间为5分钟。预估其他梯度洗涤时间,可以促使结果进一步优化。

分析不同流速、不同柱温,对紫杉醇以及各杂质的分离情况,结果发现,在各种分离条件均满足情形下,选择为每分钟0.6mL的速度。可以促使要求达到满足,分析时间减少,柱温40℃时,紫杉醇能够与杂质相互分离。

细致优化色谱和质谱条件,包括评估与流动相添加剂相关的加合物离子的情况。通过采用气相色谱方式,通过分析紫杉醇在含不同添加剂的溶液或流动相中规律,采用上述方式,对溶液中添加剂种类、浓度等条件作出缔选的结果高度一致。说明在建立紫杉醇定量方法时,采用高效液气相色谱是一种可行的优化方案[9-10]。上述方式具有经济环保、高效特点,是分析紫杉醇的重要方法,具有可靠性和有效性。通过分析紫杉醇裂解规律,发现紫杉醇质谱特点,说明紫杉醇特征性碎片例子。通过采用分离鉴定方式,鉴定紫杉醇在人体中的代谢物,推测出代谢物的代谢途径与产物。紫杉醇裂解期间,主要核心内容为脱水和酷键断裂,其中碎片离子数量较多,同时稳定性较好[11-12]。紫杉醇包含3个代谢物,主要代谢物为6α-羟基。通过分析紫杉醇代谢物质谱行为,通过定量分析,或者质谱定性分析方式,能够提供良好参考。本次研究所用方案,生物品检测与高通量要求需要得到满足,在注射阶段,使用紫杉醇聚合物胶束,检测结果更加良好。

综上所述,文章结果发现高效液相色谱法测定紫杉醇注射液相关物质含量具有良好耐用性和灵敏度,为注射紫杉醇制剂的有关物质检测提供良好方法。