巨大芽孢杆菌对雪茄烟叶品质及细菌群落结构的影响

李林玮，毛亚浩，余 君，陈 雄，杨春雷，姚 兰

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；2.湖北省烟草科学研究院，湖北 武汉 430030）

雪茄是一种卷烟制品，具有独特的香气，由茄衣、茄套、茄芯3 部分组成，其中茄芯是雪茄的主体部分，对吸食的风味特征起主导作用[1]。发酵是提高雪茄烟叶品质的重要环节，而在这一过程中微生物发挥着重要作用。经过发酵的烟叶刺激性大大降低，香气也更加突出[2-3]。烟叶发酵方式分为自然发酵和人工发酵，自然发酵时间较长、成本也高[4]。研究表明，在烟叶发酵过程中人工添加微生物能缩短发酵时间，增加香气，改善烟叶品质[5]。因此在雪茄烟叶中添加微生物进行发酵，对提高雪茄的品质具有重要的意义。

大量研究表明，微生物在烟叶发酵中应用广泛，且在改善烟叶品质的过程中发挥着重要作用[6-8]。 李宁等[9]将蜡样芽孢杆菌添加到雪茄烟叶表面进行人工发酵，发现烟叶含氮化合物含量显著降低，烟叶刺激性和劲头明显得到改善，香气增加。黄申等[10]将嗜麦芽窄食单胞菌制成菌剂后加入烟叶中进行发酵，发酵后烟叶香气质有所提升。蔡文等[11]在烟叶中添加具有产蛋白酶能力的高斯芽孢杆菌进行发酵，发现烟叶的刺激性、杂气降低，香气增加。薛云等[12]采用芽孢杆菌ZZ-8 固态发酵技术处理烟叶，发现发酵后的烟叶香气质有所提升，刺激性、杂气降低，吸食品质提高。

近年来，随着高通量测序技术的发展，对烟叶的研究不仅仅局限于添加微生物探究烟叶品质的变化上，还包括利用宏基因组学进一步分析烟叶中的微生物多样性[13-14]。张鸽等[6]对雪茄外包皮烟叶表面细菌多样性的研究发现，细菌群落演替由发酵前的棒状杆菌属、假单胞菌属变为发酵后期的葡萄球菌属。张磊等[15]通过对雪茄烟叶不同发酵阶段微生物多样性的研究发现，葡萄球菌、四链球菌为烟叶发酵过程中的优势细菌属。细菌作为雪茄烟叶中主要的微生物种类，在烟叶发酵中发挥着重要作用[16]。郑霖霖等[17]研究发现，细菌和真菌的多样性随着发酵时间的延长呈降低趋势，葡萄球菌和曲霉属为雪茄茄芯烟叶发酵过程中的优势菌属。郑天飞等[18]通过高通量测序对不同产地的雪茄烟叶微生物群落进行研究发现，不同产地的雪茄烟叶表面优势细菌属为葡萄球菌、鞘氨醇单胞菌、假单胞菌，优势真菌属为曲霉。

基于外源微生物在发酵雪茄烟叶品质形成过程中的重要影响，研究以前期筛选得到的一株可产蛋白质酶、淀粉酶和木质素酶的巨大芽孢杆菌为材料，将其与营养物质一同添加到茄芯烟叶中进行发酵，探究其对雪茄烟叶主要化学成分、感官品质和细菌群落结构的影响，以期为人工添加微生物发酵，提升茄芯烟叶的发酵品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以湖北恩施州晾制结束的CX-014 雪茄茄芯中部烟叶为供试烟叶。供试菌种为实验室保藏的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium） m1。

主要试剂有胰蛋白胨（北京双旋微生物培养基制品厂）、酵母粉（苏州嘉叶生物科技有限公司），其余试剂均来自于国药集团化学试剂有限公司。

主要仪器设备有恒温恒湿培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、恒温培养振荡器（天津欧诺仪器仪表有限公司）、冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）、高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

发酵培养基配方：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，去离子水1 000 mL，pH 值7.2～7.4。

1.2 试验方法

1.2.1 雪茄烟叶箱式发酵 参照李磊[19]的方法并进行改进，取7.5 kg 烟叶回潮至水分含量为30%，将Bacillus megateriumm1 接种于发酵培养基，培养至对数生长期，离心取菌体。将菌体（按烟叶重量添加10%的菌体）与营养液（1%谷氨酸、2%葡萄糖）混合后，用雾化小喷壶均匀喷洒在烟叶上，平衡水分后装入纸箱中，设置自然发酵（只加水，Y2）和Bacillus megateriumm1 加营养液（Y6）2 个箱式发酵处理，发酵前的烟叶记为Y0。在烟叶中心放置温度探头，设置湿度为80%，初始温度为30℃，当烟叶中心温度达到设定温度后，恒温恒湿箱温度以2℃的速度依次递增，当烟叶中心温度达到45℃时翻堆，翻堆2 次后结束发酵。

1.2.2 烟草常规化学成分的测定 水溶性总糖及还原糖参照YC/T 159—2002 进行测定，总植物碱参照YC/T 160—2002 进行测定，总氮参照YC/T 161—2002 进行测定。

1.2.3 感官评价 参照YC/T 415—2011 进行烟叶感官评价。将烟叶样品送至湖北省烟草科学研究院，由评吸专家以盲评的方式采用10 分制评吸方法对烟叶刺激性、苦感、杂气、烤香和木香等5 个指标进行感官评价，各指标评分标准见表1。

表1 雪茄烟叶感官评价各指标评分要求

1.2.4 雪茄烟叶表面微生物的收集 取10 g 烟叶样品剪切成段，使其与液体充分接触；将其置于80 mL 无菌蒸馏水中，室温静置15 min，5 000 r/min 离心10 s，涡旋90 s，5 000 r/min 离心1 min，去除叶片残留；将样品在10 000 r/min 下离心10 min，收集微生物细胞；然后用洗涤缓冲液（100 mmol/L 的Tris-HCl，50 mmol/L 的EDTA-Na2，20 g/L 的聚乙烯吡咯烷酮，1 mL/L 的吐温－20，1.4 mol/L 的NaCl，pH值为8）洗涤细胞颗粒；室温旋转45 s，65℃水浴5 min，6 000 r/min 离心6 min；重复洗涤直至上清液几乎无色，然后收集微生物细胞。建议沉淀的量在200 mg 以上。微生物沉淀用液氮速冻20 min 以上，然后转入－80℃冰箱中保存。

1.2.5 DNA 提取建库及宏基因组测序 收集好的微生物菌体沉淀送至上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA 提取建库以及后续的宏基因组测序。

1.3 数据处理

所有试验均设置3 个平行，采用Origin 2019 软件进行分析作图、美吉生信云在线平台进行微生物多样性分析。

2 结果与分析

2.1 Bacillus megaterium m1 对雪茄烟叶化学成分及感官品质的影响

从图1 可以看出，烟碱、还原糖、总糖、总氮含量在发酵后均呈下降趋势，相比于自然发酵前，自然发酵后4 种物质的含量分别降低了8.55%、24.82%、14.29%、7.03%； 而Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后4 种物质分别比发酵前下降了17.31%、71.64%、55.81%、10.61%；与自然发酵相比，添加巨大芽孢杆菌和营养液协同发酵后，雪茄烟叶中烟碱、还原糖、总糖含量分别降低了9.58%、9.52%、9.53%；这说明Bacillus megateriumm1 加营养液协同发酵在一定程度上改善了雪茄烟叶的品质。

图1 雪茄烟叶发酵前后烟叶化学成分的变化

由图2 可知，发酵前雪茄烟叶刺激性较大，苦味明显，杂气重，烤香和木香都不突出，而经过自然发酵和Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后感官评价各指标均有了明显改善。相比于自然发酵，Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后，雪茄烟叶刺激性进一步降低，苦味、杂气明显改善，烤香、木香等香味得到提升。这说明经过Bacillus megateriumm1 加营养液协同发酵后，烟叶的刺激性、杂气、苦感等显著降低，烟叶品质明显提高。

图2 雪茄烟叶发酵前后的感官评价

2.2 雪茄烟叶化学成分与感官评定相关性程度分析

为进一步研究雪茄烟叶化学成分与感官评定指标间的关系，对其进行相关程度分析，结果如图3所示。烟叶中烟碱、总糖、总氮含量与苦感、杂气、刺激性均呈正相关，还原糖、总糖、总氮含量与烤香和木香均呈负相关。这种成分含量与感官指标之间的相关关系正好解释了Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后，还原糖、总糖、烟碱、总氮含量降低，烟叶感官品质明显改善的试验结果。

图3 雪茄烟叶化学成分与感官评定的相关程度分析

2.3 Bacillus megaterium m1 对雪茄烟叶表面细菌群落影响

2.3.1 细菌α 多样性分析 多样性可以用来反映物种组成的多样性和丰富度。雪茄烟叶表面细菌多样性指数如表2 所示，与Y0（发酵前烟叶）相比，Y2（自然发酵后烟叶）的细菌多样性和物种组成存在较大差异。Chao 指数通常用来估计物种总数，自然发酵后烟叶的物种总数显著降低（从发酵前13 432.33 降至发酵后4 880.33）。Simpson 指数和Shannon 指数常用来估计样本中微生物的多样性，Simpson 指数值越大，说明群落多样性越低，Shannon 值越大，说明群落多样性越高。表2 的结果显示，与发酵前相比，自然发酵烟叶的Simpson 指数显著上升，从发酵前的0.02 上升至0.56，Shannon指数明显降低，从发酵前的5.47 下降至1.47，这说明经过自然发酵后，烟叶表面细菌多样性显著降低；而相较于自然发酵后的雪茄烟叶，Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后雪茄烟叶的Chao 指数显著降低，Shannon 指数有所降低，而Simpson指数稍微升高，表明烟叶表面的细菌多样性有所降低，这意味着Bacillus megateriumm1 加营养液可能在一定程度上加速了细菌群落的自然演替进程。

表2 雪茄烟叶表面细菌群落α 多样性分析

2.3.2 细菌OTU 分析 雪茄烟叶发酵过程中表面细菌群落结构存在显著差异，由图4 可知，门水平上，发酵前烟叶（Y0）表面有109 个OTU，属水平上有2 378 个OTU，而自然发酵后烟叶（Y2）在门水平仅有29 个OTU，属水平为1 137 个OTU，其中发酵前属水平上特有的细菌OTU 有1 265 个，自然发酵后仅为24 个OTU。图5 为自然发酵后烟叶与Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后烟叶（Y6）表面细菌多样性的韦恩图，由图5 可知，与自然发酵后烟叶相比，Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后烟叶表面细菌门水平和属水平上细菌OTU 均显著降低，门水平上只有22 个OTU，属水平上为739个OUT，其中自然发酵后烟叶门水平上特有的细菌OTU 为 9 个，属水平上有442 个，而经过Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后门水平上特有的细菌OTU 仅为2 个，属水平上为44 个 。

图4 基于门水平（A）和属水平（B）自然发酵细菌OTU 分布的韦恩图

图5 基于门水平（A）和属水平（B）不同发酵后细菌OTU 分布的韦恩图

综上所述，雪茄烟叶的发酵进程可能与其表面细菌群落演替存在一定的相关性。与发酵前相比，自然发酵后雪茄烟叶表面细菌多样性显著降低，而在添加Bacillus megateriumm1 和营养液发酵后，细菌多样性又进一步降低，说明Bacillus megateriumm1加营养液发酵可能在一定程度加速了雪茄烟叶表面细菌群落的演替进程，这与雪茄烟叶表面细菌群落 多样性分析的结果一致。

2.3.3 细菌群落组成分析 雪茄烟叶表面细菌群落相对丰度的变化如图6、图7 所示。从门水平（图6）来看，发酵前烟叶（Y0）表面优势细菌主要为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），自然发酵后烟叶（Y2）以厚壁菌门（Firmicutes）为主，其相对丰度可达到93.36%，Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后烟叶（Y6）表面的优势细菌也是厚壁菌门（Firmicutes），相对丰度可达到97.40%。从属水平（图7）来看，发酵前雪茄烟叶表面优势细菌属为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、Aureimonas、假单胞菌属（Pseudomonas）等，自然发酵后烟叶表面优势细菌属发生了显著变化，葡萄球菌属（Staphylococcus）成为绝对优势细菌属，相对丰度达91.59%，Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后烟叶表面优势细菌属也为葡萄球菌属（Staphylococcus），相对丰度达95.55%，而发酵前相对丰度较高的鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌属、Aureimonas、假单胞菌属等发酵后相对丰度均下降。这说明雪茄烟叶发酵后，葡萄球菌属会成为绝对优势细菌属，其可能与雪茄烟叶的发酵进程密切相关。但相比于自然发酵，人工添加Bacillus megateriumm1 和营养液会在一定程度上加速烟叶表面细菌的群落演替，从而促进雪茄烟叶发酵进程。

图6 不同雪茄烟叶表面门水平上的细菌相对丰度

图7 不同雪茄烟叶表面属水平上的细菌相对丰度

细菌群落互作关系分析结果（图8）表明，在雪茄烟叶发酵过程中，细菌群落之间存在着显著的相互作用。相对丰度较高的葡萄球菌属（Staphylococcus）与其余菌属均呈负相关，而其余菌属间均呈正相关。这说明在雪茄烟叶发酵过程中，细菌群落除葡萄球菌属外，其余菌属间为共生关系，葡萄球菌与其余菌属为竞争关系。这可能是因为葡萄球菌更能适应烟叶表面的环境，从而更好地利用雪茄烟叶中的营养物质，实现快速生长，同时这也解释了葡萄球菌属细菌在雪茄烟叶发酵过程中相对丰度显著增加，发酵后成为雪茄烟叶表面绝对优势微生物的原因。通过雪茄烟叶细菌群落（属水平）与KEGG 功能贡献度分析结果（图9）可以看出，在属水平上丰度排名前十的物种中，发酵前烟叶（Y0）中对次级代谢物的生物合成、不同环境微生物的代谢、氨基酸的生物合成、ABC 转运等功能途径贡献度较高的细菌属主要为鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌属。而自然发酵后烟叶（Y2）和Bacillus megateriumm1加营养液发酵后烟叶（Y6）中对功能途径贡献度较高的主要为葡萄球菌属。与自然发酵后烟叶相比，Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后烟叶中葡萄球菌属的贡献度较高，可达98%以上。这说明葡萄球菌在发酵过程中对雪茄烟叶内部的功能途径有着显著影响，而这些功能途径与雪茄烟叶的香气产生可能有密切联系；同时，也意味着加入Bacillus megateriumm1 和营养物质可能会协同促进雪茄烟叶的发酵进程，进而提高雪茄烟叶的品质。

图8 雪茄烟叶细菌群落互作关系分析

图9 雪茄烟叶细菌群落与KEGG 功能贡献度分析

2.3.4 细菌多样性与环境因子的关联分析 为了确定雪茄烟叶细菌群落与化学成分和感官品质之间的关系，对其进行相关性热图分析，结果见图10。从图10A 可以看出，葡萄球菌属（Staphylococcus）与还原糖、总糖、烟碱呈显著负相关，甲基杆菌属（Methylobacterium）、Auremonas、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）与其均呈显著正相关。从图10B 可以看出，葡萄球菌属（Staphylococcus）与刺激性、杂气、苦味等不良指标呈显著负相关，而甲基杆菌属、Auremonas、鞘氨醇单胞菌属与其均呈显著正相关，葡萄球菌属与烤香呈显著正相关，其余菌属与其呈负相关。这在一定程度也说明了在雪茄烟叶发酵过程中，细菌群落的演替，特别是葡萄球菌相对丰度的增加，对雪茄烟叶品质的提高有重要的影响。

图10 雪茄烟叶细菌群落与化学成分（A）及感官评价（B）的相关程度分析

3 讨 论

雪茄烟叶主要化学成分包括还原糖、总糖、总氮、烟碱等指标，其含量与烟叶的内在质量密切相关[20]。研究表明，烟叶中糖类物质在燃吸过程中可适度平衡烟气，使雪茄烟的吃味更加醇和，糖类物质含量过高会破坏烟气的协调与平衡，使得烟气平淡无味[21]；含氮化合物含量过高，雪茄烟燃烧时会产生挥发性碱性物质，使烟气的碱性和刺激性增强，进而影响雪茄烟的品质[22]；烟碱含量过高会影响雪茄烟的烟气特征和安全性，适量的烟碱可以给吸食者带来更好的体验感[23]。感官评定也是判断雪茄烟发酵效果的重要指标之一，是烟叶质量评价的主要手段和重要依据[24]。雪茄烟叶化学成分及感官评价结果表明，Bacillus megateriumm1 加营养液协同发酵后烟叶的还原糖、总糖、总氮、烟碱含量下降幅度较大。感官评价结果表明，相比于其他处理，Bacillus megateriumm1 加营养液发酵处理的雪茄烟叶刺激性、苦味、杂气等不良指标得到明显改善，烤香、木香等香味更突出，这可能是由于加入的营养液中含有葡萄糖和谷氨酸，而氨基酸和葡萄糖在一定条件下会发生美拉德反应，产生致香物质；另外，Bacillus megateriumm1 具有产蛋白酶、淀粉酶、木质素酶的能力，能降解烟叶中的蛋白质、淀粉、木质素等大分子物质，进而改善烟叶品质。毛多斌等[25]在烟叶中添加枯草芽孢杆菌发酵后，烟叶的刺激性降低，香气质和香气量明显提高。Li 等[26]在雪茄烟叶中添加纤维素降解菌和营养物质（葡萄糖、谷氨酸）进行发酵，发现雪茄烟叶香气量显著提升。这说明在雪茄烟叶发酵过程中添加外源微生物和营养物质能显著改善雪茄烟叶品质。

为了进一步探究Bacillus megateriumm1 加营养液改善雪茄烟叶品质的作用机制，分析了不同发酵处理前后雪茄烟叶表面的细菌多样性。细菌群落结构分析结果表明，相比于发酵前，自然发酵和Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后雪茄烟叶表面的细菌多样性和丰度均显著降低，其中Bacillus megateriumm1 加营养液发酵处理的细菌多样性和丰度下降幅度较大，说明Bacillus megateriumm1 加营养液更有助于促进雪茄烟叶表面细菌群落的演替，这与Liu 等[27]关于发酵前后微生物多样性的研究结果基本一致。细菌群落组成结果表明，在门水平上，发酵前雪茄烟叶表面的优势细菌门主要为变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，而在自然发酵后、Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后雪茄烟叶表面均以厚壁菌门为主，其中Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后厚壁菌门相对丰度较高，可达97.40%；在属水平上，发酵前雪茄烟叶表面细菌种类较丰富，其优势菌属为鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌属、Aureimonas、假单胞菌属等，自然发酵后、Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后雪茄烟叶表面均以葡萄球菌属为绝对优势细菌属，其中Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后葡萄球菌属的相对丰度较高，可达95.55%。这与叶长文等[28]通过高通量测序发现发酵后雪茄烟叶表面优势菌门为厚壁菌门，优势菌属为葡萄球菌属的研究结果一致。

通过互作关系分析可知，葡萄球菌与其余菌属均存在竞争关系，这也解释了发酵后期葡萄球菌属成为雪茄烟叶表面绝对优势微生物的这一现象。细菌群落与KEGG 功能贡献度分析发现，相比于其他处理，Bacillus megateriumm1 加营养液发酵后，雪茄烟叶表面的葡萄球菌属微生物对丰度排名前5 的代谢途径贡献度均较高，可达到98%以上，说明葡萄球菌属微生物对发酵过程中烟叶内部的功能途径有显著影响，而烟叶内部的功能途径又与烟叶的香气品质及内在质量密切相关。这意味着加入Bacillus megateriumm1 和营养液协同发酵在一定程度上可促进雪茄烟叶细菌群落演替和发酵进程，提高雪茄烟叶的品质。Zhang 等[29]研究发现，在雪茄烟叶表面接入不动杆菌可促进微生物演替和烟叶发酵进程，缩短发酵时间。而该试验利用Bacillus megateriumm1 和营养液协同发酵也取得了相似结果。

在细菌群落和功能分析的基础上，对雪茄烟叶细菌群落与主要化学成分和感官品质的相关性进行研究，结果表明，葡萄球菌与还原糖、总糖、烟碱呈显著负相关，与烟叶的杂气、刺激性、苦味等不良指标也显著负相关。这进一步说明在发酵过程中，葡萄球菌的相对丰度增加，可能对雪茄烟叶品质的改善发挥重要作用。研究还发现，葡萄球菌会参与脂肪代谢，并产生大量的脂肪酸，脂肪酸可以进一步降解形成醛类、甲基酮等香气物质，是烟叶香气的主要来源[30-31]。国内外关于葡萄球菌在食品领域的应用已有大量报道，该菌有助于改善发酵食品的感官，包括颜色、香气和味道[32]。Wang 等[33]研究发现，添加植物乳杆菌和葡萄球菌发酵后的肉饭中橙花醇、醛类和部分氨基酸含量显著提高，发酵肉饭的风味品质得到明显改善。Li 等[34]在奶酪中添加乳杆菌和葡萄球菌进行发酵，发现奶酪中的蛋白质、游离脂肪酸含量显著增加，奶酪的风味品质明显提升。但关于葡萄球菌在雪茄烟叶中应用和发酵作用机制的研究鲜见报道，还有待进一步研究。

总的来看，在雪茄烟叶发酵过程中添加巨大芽孢杆菌和营养液协同发酵，可推动雪茄烟叶发酵进程，加速细菌群落演替，并明显改善雪茄的香气品质和安全性，降低烟叶杂气。