GC-MS/HPLC法分析注射用头孢美唑钠丁基胶塞中有机成分及其迁移*

张凤妹,陈丹丹,徐兵勇,梁键谋,刘珊,袁利佳

(1.浙江省食品药品检验研究院,国家药品监督管理局仿制药评价关键技术重点实验室&浙江省药品接触材料质量控制研究重点实验室,杭州 310052;2.浙江工业大学,杭州 310014;3.国家药品监督管理局药品审评中心,北京 100022)

丁基胶塞是瓶装药品密封材料的重要组成部分,但在胶塞加工时会加入一些化学助剂,且需要经过硫化过程,会在胶塞本体内残留不参与反应的物质等。胶塞在贮存过程中,这些物质迁移至胶塞表面,从而影响或者污染药物[1-2]。有些品种的抗菌药物注射用粉针制剂贮存过程中,尤其是β-内酰胺类抗菌药物,存在溶液澄清度超标现象,有可能和所用胶塞质量有关。因此有必要研究和控制丁基胶塞的质量。

注射用头孢美唑钠属于β-内酰胺类抗菌药物,通过无菌分装制得。胶塞会影响β-内酰胺类抗菌药物粉针剂的质量[3-5],但对头孢美唑钠粉针剂质量的影响目前未见报道。本文参考相关文献[6-9],采用气质联用色谱法(GC-MS)全扫描(SCAN)模式对注射用头孢美唑钠丁基胶塞中及迁移入药品粉末中的有机挥发性成分进行结构鉴定,为进行药用丁基胶塞与药物之间的相容性考察奠定一定基础[10];在有机成分定性分析的基础上,建立高效液相色谱(high-pressure liquid chromatograph,HPLC)法,对从丁基胶塞迁移入药品中的挥发性成分进行定量分析。阐述注射用头孢美唑钠包材与药物之间相容性的物质基础,并初步建立胶塞浸出物的风险控制和评价方法,为注射用头孢美唑钠丁基胶塞的选择、质量控制、胶塞配方和工艺改进提供技术支持。

1 GC-MS(SCAN模式)法定性分析丁基胶塞中及迁移入药品粉末中的有机成分

1.1仪器与试药 安捷伦8890-5977B气质联用仪,安捷伦7697A 顶空进样器,软件版本(Version 10.0.368);深圳华润九新药业有限公司(A)、福建省福抗药业股份有限公司(B)、四川合信药业有限责任公司(C)、广州白云山天心制药股份有限公司(D)、哈药集团制药总厂(E)注射用头孢美唑钠样品及胶塞;4种胶塞华峰(a)、博生(b)、乐清(c)、华仁(d)(其中华峰是覆膜丁基胶塞,其他是丁基胶塞。自行填装四川合信头孢美唑钠),由国内生产企业提供。

1.2方法与结果

1.2.1气质联用条件 HP-INNOWax毛细管色谱柱(30.0 mm×0.32 mm,0.5 μm);载气为He,流速2.0 mL·min-1;进样口200 ℃;分流比10：1;程序升温:起始柱温50 ℃保持5 min,以10 ℃·min-1升至200 ℃,维持5 min。顶空温度120 ℃;平衡30 min;进样量1 mL;电子轰击源(EI),轰击电压70 eV,离子源温度240 ℃,接口温度260 ℃,质量分辨率1 amu,采用全扫描方式,扫描范围m/z50～600。

1.2.2实验条件加速试验样品:在40 ℃、相对湿度为75%中倒置(胶塞向下放置)3个月。

1.2.3样品制备 取注射用头孢美唑钠的丁基胶塞,剪碎后,取约1.0 g置顶空瓶中;取头孢美唑钠粉末约1.0 g置顶空瓶中,顶空进样测定。

1.2.4测定结果 采用GC-MS法SCAN模式对丁基胶塞中及迁移入药品粉末中的挥发性成分进行成分分析,结果见图1。通过质谱库检索,鉴定了丁基胶塞和迁移入药品粉末中的有机成分的结构,丁基胶塞中存在抗氧剂(264及异构体)、硅氧烷类化合物(八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷),发现存在微量饱和长链烷烃类化合物(正十二烷、正十四烷、正十五烷等)。由图2 GC-MS总离子流中质谱峰强度可知,注射用头孢美唑钠胶塞中存在迁移物质。

A.抗氧剂BHT;B.抗氧剂BHT异构体;C.八甲基环四硅氧烷。图1 丁基胶塞和对应药品粉末中有机成分的MS图和可能结构 A.antioxygen BHT;B.antioxidant BHT isomer;C.octamethylcyclotetrasiloxane.Fig.1 MS digrams and possible structures of organic components in butyl rubber plugs and correponding drug powders

在GC-MS法对胶塞中及迁移入样品中有机物成分定性分析的基础上,确定需要进行定量的成分,考虑到BHT、硫化剂等沸点较高,故参照USP现行版及相关文献[11-17],采用HPLC法对丁基胶塞及迁移入药品中的抗氧剂、硫化剂做进一步定量分析。通过对随机抽取的头孢美唑钠胶塞中有机物成分及迁移定量测定,为进而开展药品包材和药物之间相容性研究奠定了一定的基础。

2 HPLC法定量分析从丁基胶塞迁移入药品粉末中的抗氧剂和硫化剂

文献[7-9]报道丁基胶塞中抗氧剂会迁移至样品中,引起溶液浑浊的现象,导致溶液的澄清度不合格。丁基胶塞中硫的溶解性较低,会产生喷霜现象,不仅会破坏硫的分散均匀性,降低粘着性,使加工困难,而且会影响被包装药物的质量[10]。本研究作者建立了有机溶剂回流萃取的方法对其进行提取,并以HPLC法进行测定,快速准确地同时测定药用丁基胶塞中抗氧剂和硫化剂的含量。

2.1仪器与试药 安捷伦1 260高效液相色谱仪,DAD检测器,色谱柱:Inertsil ODS-3 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。抗氧剂和硫化剂对照品及所用的试剂信息汇总表见表1。

表1 抗氧剂、硫化剂对照品和试剂信息汇总Tab.1 Summary of antioxidant,vulcanizing agent reference and reagent information

2.2方法与结果

2.2.1色谱条件 色谱柱:Inertsil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇;流速:1.0 mL·min-1;柱温:35 ℃;紫外检测波长220 nm;进样量:20 μL。

2.2.2溶液的配制

(1)供试品溶液的制备。称取头孢美唑钠样品约1.0 g,置于10 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,转移至分液漏斗中,加甲苯萃取10 mL,共萃取3次。合并萃取液,45 ℃真空旋干,用二氯甲烷0.5 mL使溶解,完全转移至5 mL量瓶中,用甲醇洗涤合并至量瓶,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用孔径0.45 μm滤膜滤过,取续滤液。

(2)丁基胶塞提取液的制备。取胶塞,剪碎,精密称取约8 g,置于底烧瓶中,加入甲苯80 mL后回流2 h,冷却至60 ℃,边搅拌边加入甲醇120 mL,过滤,用甲苯-甲醇(40：60)混合液25 mL冲洗烧瓶和漏斗,合并洗液和滤液至250 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。量取25.0 mL,45 ℃真空蒸干,加二氯甲烷0.5 mL使溶解,完全转移至5 mL量瓶中,用甲醇洗涤合并至容量瓶并稀释至刻度,摇匀,用孔径0.45 μm滤膜,取续滤液。

2.2.3标准曲线溶液的制备 分别精密称取抗氧剂264、1 010、330、1 076、168和硫对照品各约20 mg,分别置于20 mL量瓶中,加二氯甲烷2 mL使溶解,用甲醇稀释至刻度,摇匀,作为各自对照品储备液。分别量取上述各对照品储备液各5.0 mL,置于50 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品储备液(约100 μg·mL-1)。取混合对照品储备液,逐级稀释制成标准曲线系列溶液。

2.2.4精密度实验 取“2.2.3节”下2.5 μg·mL-1混合对照品溶液,连续进样6针,测定,抗氧剂264、1 010、330、1 076、168和硫峰面积RSD依次为1.9%、1.0%、0.6%、1.5%、1.2%和0.8%。

2.2.5线性关系考察 精密量取“2.2.3节”下系列混合对照品溶液20 μL,照“2.2.1节”下色谱条件,进样测定。试验结果表明上述抗氧剂和硫化剂在0.5～100 μg·mL-1范围内线性关系良好,结果见表2。

表2 抗氧剂和硫化剂线性关系结果Tab.2 Result of the linear of antioxidant,vulcanizing agent

2.2.6准确度实验 精密量取2.2.2项下胶塞提取液25 mL各三份,分别加入混合对照品储备液62.5、125、187.5 μL,45 ℃真空蒸干,用二氯甲烷0.5 mL溶解,完全转移至5 mL量瓶中,用甲醇洗涤合并至量瓶,用甲醇稀释至刻度,摇匀即得低、中、高浓度约为1.25、2.5、3.75 μg·mL-1的溶液,用孔径0.45 μm滤膜滤过后测定。各浓度供试品加样溶液中抗氧剂264、1 010、330、1 076、168和硫平均回收率(低、中、高)均在90.0%～110.0%之间,均RSD<10%,结果见表3。

表3 胶塞中抗氧剂和硫化剂的回收率测定结果Tab.3 Determination results of recovery of antioxidant and vulcanizing agent in rubber plug n=9

2.2.7稳定性实验 取“2.2.3节”下2.5 μg·mL-1混合对照品溶液,于室温0、3、9、21、24 h依次进样,测定抗氧剂和硫化剂的峰面积,结果抗氧剂264、1 010、330、1 076、168和硫峰面积基本无变化,RSD均<2.0%,表明在24 h内稳定性良好。

2.2.8检测限和定量限 取“2.2.3节”下混合对照品溶液,适当稀释,配制抗氧剂和硫化剂的检测限(S/N≈3)和定量限溶液(S/N≈10),结果见表4。

表4 抗氧剂和硫化剂检测限和定量限测定结果Tab.4 Results of antioxidant and vulcanizing agent detection limit and quantitation limit determination

2.2.9样品测定 取深圳华润九新药业有限公司、福建省福抗药业股份有限公司、四川合信药业有限责任公司、广州白云山天心制药股份有限公司、哈药集团制药总厂样品中的胶塞(编号对应为A、B、C、D、E)和四种药用丁基胶塞(编号对应为a、b、c、d),按“2.2.2节”下方法制备胶塞提取溶液,依法测定,用标准曲线法计算胶塞中中抗氧剂和硫化剂含量。胶塞中抗氧剂、硫化剂的提取测定结果测定结果见表5,典型色谱图见图3。同时为了验证胶塞中抗氧剂和硫化剂的迁移,对编号为四种药用丁基胶塞(编号对应为a、b、c、d)的4种胶塞直接接触对应的药品粉末进行检测,同时对四种胶塞填装头孢美唑钠加速试验3个月样品的头孢美唑钠药品粉末中抗氧剂和硫化剂也进行测定,分析测试条件和方法同“2.2.1节”下,结果表明5家企业的头孢美唑钠药品粉末中和4种胶塞填装头孢美唑钠加速样品中均检测到抗氧剂264,除A、C、d样品外,均检测到硫,说明胶塞中抗氧剂和硫化剂浸出并迁移至药品中。药品粉末中抗氧剂、硫化剂的测定结果见表6,表7。

表5 胶塞中抗氧剂、硫化剂的提取测定结果汇总表Tab.5 Summary of extraction and determination results of antioxidant and vulcanizing agent in rubber plug μg·mL-1

表6 5家企业样品的药品粉末中抗氧剂、硫化剂测定结果Tab.6 Determination results of antioxidant and vulcanizer in samples from five enterprises μg·mL-1

表7 加速实验3个月后药品粉末中抗氧剂、硫化剂测定结果Tab.7 Determination results of antioxidants and vulcanizing agents in each drug powder after three-month accelerated test μg·mL-1

A.混合对照品溶液(100 μg·mL-1);B.华润九新胶塞提取液中抗氧剂和硫化剂;C.华润九新样品中抗氧剂和硫化剂;D.3个月加速试验样品(四川合信)中抗氧剂和硫化剂迁移;E.空白;1.抗氧剂264;2.抗氧剂1010;3.硫;4.抗氧剂330;5.抗氧剂1076;6.抗氧剂168。图3 抗氧剂和硫化剂测定HPLC色谱图A.mixed reference solution(100 μg·mL-1);B.antioxidants and vulcanizing agent in the extract of rubber plug of Hua run jiu xin;C.antioxidants and vulcanizing agent of samples of Huarunjiuxin;D. Antioxidants and vulcanizing agent in samples (Sichuan he xin) after three month accelerated test;E.blank;1.antioxidant 264;2.antioxidant1010;3.vulcanizer;4.antioxidant 330;5.antioxidant1076;6.antioxidant168.Fig.3 HPLC chromatograms for determination of antioxidants and vulcanizing agents

由于良好的还原性能,抗氧剂264、抗氧剂1010是主要的受阻酚类抗氧剂,应控制它们迁移至药物中的量,以防止对药物产生影响。注射用头孢美唑钠3个月加速样品中抗氧剂、硫化剂的迁移量测定结果显示,抗氧剂264(BHT)在样品中的均有少量的迁移,覆膜比非覆膜胶塞中抗氧剂和硫化剂的迁移量低。另检出少量硫化剂(可提取硫)的迁移。

3 讨论

本文采用GC-MS法和HPLC法,分别对注射用头孢美唑钠胶塞中部分挥发性有机成分及迁移进行了定性分析和定量分析,发现丁基胶塞中BHT等成分会迁移进入药品中,进而影响溶液的澄清度。提示生产企业选用优质丁基胶塞,并严格控制丁基胶塞的质量,从而保证本品的质量和用药安全。

研究结果表明在抗氧剂和硫化剂的迁移方面,覆膜胶塞优于普通的丁基胶塞。建议厂家尽可能采用覆膜胶塞,提升药物的稳定性,降低胶塞浸出物对药物质量的影响。

各厂家胶塞在配方、原材料等方面差异较大,因而不同厂家胶塞中抗氧剂和硫化剂含量差异也较大。没有规定统一配方标准,因而在注射剂仿制药一致性评价中,需要对胶塞中的抗氧剂和硫化剂进行检测研究,对其迁移进行测定,评估是否存在安全风险。

本文初步建立了以丁基胶塞中常见抗氧剂和硫化剂为指针性成分的考核评价体系,为进行丁基胶塞与注射剂相容性试验以及进一步评价药用丁基胶塞的安全性和稳定性提供了可借鉴的方法。