红花绿绒蒿种子休眠解除的生理生化响应

陈红刚,赵文龙,晋 玲,高素芳,杜 弢*

(1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000; 2.西北中藏药协同创新中心,甘肃 兰州 730000;3.甘肃省珍稀中药资源评价与保护利用工程研究中心,甘肃 兰州 730000)

红花绿绒蒿(MeconopsispuniceaMaxim.)为罂粟科绿绒蒿属草本植物,生于海拔2 800～4 300 m的山坡草地、高山草甸、林缘和沟边,主要分布于四川西北部、西藏东北部、青海东南部和甘肃西南部[1],其性苦涩、微温、归肝、肾经,具有清热解毒、利尿和消炎止痛的功效,可以治疗遗精、结核、肺炎、白带、痛经和高血压等疾病[2]。

近年来,受自然环境和人为因素的影响,红花绿绒蒿野生资源遭到了严重破坏,分布范围和群体数量逐渐减少,面临着枯竭的危险[3-5],1999年我国将红花绿绒蒿列入《国家重点保护野生植物名录》(第1批)Ⅱ级重点保护植物[6]。红花绿绒蒿种子具有休眠现象,种子休眠类型为深度复杂形态生理休眠,层积处理是打破红花绿绒蒿种子休眠的有效方法[7],但其机理尚未明确。本试验通过测定分析层积过程中红花绿绒蒿种子胚形态、胚率、发芽率、营养物质、内源激素、关键酶活性等理化指标的变化规律,旨在明确种子休眠解除对生理生化指标变化的响应,为红花绿绒蒿野生资源保护和人工驯化栽培提供理论依据及技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1材料 红花绿绒蒿种子2021年8月采自青海省久治县隆格山(100°50′12.96″E,33°17′13.49″N,海拔4 317 m),由甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为红花绿绒蒿种子,阴干后室温储存。

1.1.2主要仪器及试剂 Leica-CM1950型恒冷切片机(德国徕卡公司),LeicaDM500显微镜(德国徕卡公司),ROX-400H人工气候箱(上海龙跃仪器设备有限公司),全波长酶标仪Multiskan GO(美国赛默飞世尔科技有限公司),Enppendorf5430R冷冻离心机(德国Enppendorf公司),T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),IKARV8旋转蒸发仪(艾卡(广州)仪器设备有限公司),THZ-82气浴恒温振荡器(常州金坛恒丰仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1种子层积处理 参照陈红刚等[7]的方法进行,随机称取阴干红花绿绒蒿种子6份,每份10.0 g,1份不做层积处理(CK),于4℃冰箱中保存,其余5份进行连续变温层积处理,具体为:处理Ⅰ(7℃ 20 d),处理Ⅱ(7℃ 20 d+4℃ 20 d),处理Ⅲ(7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d),处理Ⅳ(7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+-4℃ 20 d),处理Ⅴ(7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+-4℃ 20 d+4℃ 20 d)。层积结束后取出样品,于通风处阴干、过筛,分取5.0 g种子置于4℃冰箱中保存,进行种子质量指标测定,剩余种子经液氮冷冻后置于-80℃低温冰箱中保存,进行种子生理生化指标测定。

1.2.2种子胚形态及胚率观测 分别取4℃保存的各处理种子30 粒,蒸馏水浸泡12 h,OCT胶水常温包埋10 min,冷冻包埋5 min(-20℃),Leica-CM1950型恒冷切片机切片(厚0.15 mm),LeicaDM500显微镜观察种胚形态(目镜10 倍,物镜40 倍),测量胚长和胚乳长,计算胚率[8]。

1.2.3种子发芽指标测定 参照陈红刚等[7]的方法进行,分别取4℃保存的各处理种子300 粒,用0.1%的升汞消毒10 min,蒸馏水冲洗5次,播于沙床上(细沙2～3 mm),每皿播种50 粒,6次重复,在10℃全黑暗条件下培养,以胚根突破种皮、胚芽为种子长1/2为种子发芽标准,每天统计发芽情况,及时补足水分,第23 d统计发芽率。

1.2.4种子生理生化指标测定 分别取-80℃保存的各处理种子,采用考马斯亮蓝法测定种子可溶性蛋白含量,采用蒽酮比色法测定淀粉和可溶性糖含量,采用ELISA酶联免疫法测定丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)活性、琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)活性和6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G-6-PDH)活性,具体操作按试剂盒说明进行,每个处理3次重复。蛋白定量试剂盒(批号:20210622)、植物可溶性糖检测试剂盒(批号:20210422)、淀粉含量检测试剂盒(批号:20210429)、PK试剂盒(批号:20210329)、SDH测试盒(批号:20210329)购于南京建成生物工程研究所,G-6-PDH检测试剂盒(批号:202103)购于上海钦诚生物科技有限公司。

分别取-80℃保存的各处理种子0.1 g,采用LC-MS/MS法测定种子内赤霉素(Gibberellic acid,GA)、吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)含量,每个处理3次重复。检测工作委托上海拜谱生物科技有限公司测定,测定条件为:

质谱:QTRAP 5500 质谱仪(AB SCIEX)。

色谱:Shimadzu Nexera X2 LC-30AD。

色谱柱:Waters Acquity UPLC HSS T3 column (1.7 μm 2.1×100 mm Column)。

试剂:乙腈(millipore,1.00030.4008)、乙酸铵(Sigma,73594)、甲醇(millipore,1.06007.4008)。所有植物激素标准品均购自Sigma-Aldrich或上海源叶生物科技有限公司)。

1.2.5数据处理 使用Excel 2013软件进行相关数据整理及制图,采用SPSS 25.0分析软件进行单因素方差分析、多重比较(LSD法)和Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 层积对红花绿绒蒿种子胚发育及发芽率的影响

未层积和层积初期红花绿绒蒿种子胚发育时期多处于球型期(图1A)或心型期(图1B),种胚未发育成熟,随着层积时间的增加,种胚持续发育,经历心型胚后期(图1C)、鱼雷型胚(图1D),最终发育成子叶型胚(图1E),完成形态后熟。

图1 红花绿绒蒿种胚形态Fig.1 Embryo morphology of Meconopsis punicea注:A,球型胚;B,心型胚;C,心型胚后期;D,鱼雷型胚;E,子叶型胚Note:Panel A,globular embryo;Panel B,heart-shaped embryo;Panel C,late heart-shaped embryo;Panel D,torpedo-shaped embryo;Panel E,cotyledon-shaped embryo

种子胚率、发芽率在层积过程中呈上升趋势(图2A,2B)。未层积种子(CK)胚率仅为18.5%,层积处理期间胚率快速增长,处理Ⅴ时达到最大值(87.5%),显著大于未层积种子(CK)(P<0.05);未层积种子(CK)及处理Ⅰ至处理Ⅲ时期的种子均不发芽,处理Ⅳ之后种子休眠解除,发芽率快速升高,处理Ⅴ时达到最大值(50.0%),显著大于未层积种子(CK)(P<0.05)。

图2 不同层积处理红花绿绒蒿种子胚率及发芽率变化Fig.2 Changes of embryo rate and germination rate of M. punicea seeds in different stratification treatments注:CK为未层积种子;Ⅰ为层积处理20 d(7℃ 20 d);Ⅱ为层积处理40 d (7℃ 20 d+4℃ 20 d);Ⅲ为层积处理60 d (7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d);Ⅳ为层积处理80 d (7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+- 4℃ 20 d);Ⅴ为层积处理100 d (7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+- 4℃ 20 d+4℃ 20 d)。不同小写字母表示处理之间在 0.05 水平差异显著(P<0.05)。下同Note:CK,Unstratified seeds;Ⅰ,Stratification treatment for 20 d (7℃ 20 d);Ⅱ,Stratification treatment for 40 d (7℃ 20 d + 4℃ 20 d);Ⅲ,Stratification treatment for 60 d (7℃ 20 d + 4℃ 20 d + 0℃ 20 d);Ⅳ,Stratification treatment for 80 d (7℃ 20 d + 4℃ 20 d + 0℃ 20 d + -4℃ 20 d);Ⅴ,Stratification treatment for 100 d (7℃ 20 d + 4℃ 20 d + 0℃ 20 d + -4℃ 20 d + 4℃ 20 d). Different lowercase letters indicate that there are a significant difference between stratification treatments at 0.05 level (P<0.05). The same as below

2.2 层积对红花绿绒蒿种子营养物质含量变化的影响

红花绿绒蒿种子淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白含量在层积过程中总体呈现上升-下降-上升的趋势(图3A,3B)。淀粉含量在处理 Ⅰ 时快速升高,后连续下降,至处理Ⅴ时小幅回升并达到最大值(22.28 mg·g-1),最终含量较未层积种子(CK)显著升高(P<0.05);可溶性糖、可溶性蛋白含量在处理Ⅰ至处理Ⅲ期间持续上升,后有所降低,处理Ⅴ时再次上升并分别达到最大值(46.06 mg·g-1,38.60 mg·g-1),最终含量较未层积种子(CK)显著升高(P<0.05)。

图3 红花绿绒蒿种子层积过程中营养物质含量变化Fig.3 Changes of the nutrient contents in seeds of M. punicea in the stratification treatments

2.3 层积对红花绿绒蒿种子呼吸途径关键酶活性变化的影响

层积过程中,红花绿绒蒿种子PK活性总体呈下降趋势(图4A),处理Ⅳ时降至最低值(0.66 U·g-1·min-1),最终酶活性较未层积种子(CK)显著降低(P<0.05);SDH活性总体呈先升后降的趋势(图4B),处理Ⅳ时达到最大值(1.70 U·mg-1·min-1),最终酶活性较未层积种子(CK)显著升高(P<0.05);G-6-PDH活性呈先升后降的趋势,但总体变化比较平稳(图4C),处理Ⅱ时达到最大值(1.62 U·g-1·min-1),最终酶活性较未层积种子(CK)显著升高(P<0.05)。

图4 红花绿绒蒿种子层积过程中呼吸途径关键酶活性变化Fig.4 Changes of key enzyme activities in respiratory pathway of M. punicea seeds in the stratification treatments

2.4 层积对红花绿绒蒿种子内源激素含量变化的影响

层积过程中,红花绿绒蒿种子ABA,IAA含量总体呈下降趋势(图5A,5D),ABA含量在处理Ⅲ时降至最低(51.97 ng·g-1),最终含量较未层积种子(CK)显著降低(P<0.05);IAA含量在处理Ⅰ时急速下降,后期变化比较平稳,最终含量较未层积种子(CK)显著降低(P<0.05);GA3含量呈上下波动趋势(图5B),并在处理Ⅳ时达到最大值(10.51 ng·g-1),最终含量与未层积种子(CK)无显著性差异;GA1含量呈先升后降的趋势(图5C),但总体变化比较平稳,最终含量与未层积种子(CK)无显著性差异;ABA/GA3,ABA/GA1比值总体呈下降趋势(图5E,5F),最终比值显著低于未层积种子(CK)(P<0.05)。

图5 红花绿绒蒿种子层积过程中内源激素含量变化Fig.5 Changes of endogenous hormone content in seeds of M. punicea in the stratification treatments

2.5 红花绿绒蒿种子休眠解除过程中各指标间相关性分析

由表1可知,种子发芽率和胚率呈显著正相关关系(P<0.05),与其余指标相关关系均不显著;PK活性与淀粉含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SDH活性呈显著负相关关系(P<0.05),与ABA含量、IAA含量、ABA/GA3比值、ABA/GA1比值呈显著正相关关系(P<0.05);SDH活性与可溶性糖含量、可溶性蛋白含量呈显著正相关关系(P<0.05),与ABA含量、IAA含量、ABA/GA3比值、ABA/GA1比值呈显著负相关关系(P<0.05);G-6-PDH活性与可溶性糖含量呈显著正相关关系(P<0.05),与ABA含量呈显著负相关关系(P<0.05);ABA含量与可溶性糖含量、可溶性蛋白含量呈显著负相关关系(P<0.05),IAA含量与淀粉含量呈显著负相关关系(P<0.05),ABA含量与IAA含量、ABA/GA1比值呈显著正相关关系(P<0.05)。

表1 红花绿绒蒿种子休眠解除过程中各指标间的相关系数Table 1 Correlation analysis of indicators for the dormancy release of seeds of M. punicea in the stratification treatments

3 讨论

3.1 红花绿绒蒿种子休眠解除与胚形态发育的关系

种胚的进一步生长和发育是形态生理休眠种子得以萌发的先决条件,未分化的种胚需要经过分化,并达到一定的长度,而分化了但是发育不完全的胚也需要生长到一定的阈值才可以萌发[9]。本研究中,红花绿绒蒿种胚从球型胚、心型胚、鱼雷型胚,最终发育成子叶型胚,完成形态后熟,胚率及发芽率显著提高(P<0.05),且胚率与发芽率呈显著正相关关系(P<0.05),其他研究者在淫羊藿(Epimediumbrevicornu)[10]、大花贝母(Fritillariaverticillatavar.albidoflora)[11]上也有类似发现。同时,处理Ⅲ至处理Ⅳ期间胚率快速增长,种子开始发芽,而该时期是-4℃至0℃低温层积阶段,说明-4℃至0℃低温层积是红花绿绒蒿种胚发育的关键。

3.2 红花绿绒蒿种子休眠解除与营养物质转化的关系

种子中的储藏物质主要包括淀粉、脂肪、蛋白质和可溶性糖等,淀粉是植物体内重要的储藏物质,成熟种子内的淀粉在相关代谢酶的催化下逐步水解为可被利用的小分子物质,从而促进种子休眠的解除[12]。如黄精(Polygonatumsibiricum)种子在低温层积过程中淀粉和粗脂肪逐步分解为可溶性糖及可溶性蛋白等小分子物质,为种胚的分化发育提供能量,促进种子萌发[13]。本研究中,处理Ⅰ时期红花绿绒蒿种子淀粉含量的上升是为下一步的物质转化进行积累,处理Ⅱ至处理Ⅳ时期淀粉含量持续下降,分解为小分子物质,从而促进种子休眠解除,处理Ⅴ时期淀粉含量又开始回升,原因可能是休眠已经解除,种子开始为下一步的发芽进行物质积累。

可溶性糖是种子中最直接的供能物质,由淀粉降解产生,同时又作为呼吸底物被消耗,因此,可溶性糖含量的高低既与淀粉降解的速度有关,又与呼吸消耗的速度有关[14-15]。可溶性蛋白是部分细胞结构的基础物质,为种胚的生长提供物质能量[16]。本研究中,处理Ⅴ时期红花绿绒蒿种子可溶性糖、可溶性蛋白含量较未层积种子(CK)显著升高(P<0.05),从而促进种子休眠的解除,但处理Ⅲ至处理Ⅳ时期可溶性糖、可溶性蛋白含量均有所下降,原因可能是该时期种子胚率快速增长,代谢活动增强,可溶性糖、可溶性蛋白消耗的速度大于种子中储藏物质降解的速度,导致其含量降低。此研究结果在东北红豆杉(Taxuscuspidata)[17]、流苏树(Chionanthusretusus)[18]、垂珠花(Styraxdasyanthus)[19]上也有类似发现。

3.3 红花绿绒蒿种子休眠解除与呼吸代谢的关系

植物体内有三条最基本的呼吸代谢途径,具体为糖酵解途径(Embden-Meyerhof pathway,EMP)、三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,TCA)、磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway,PPP)[20]。PK,SDH,G-6-PDH分别是EMP途径、TCA循环、PPP途径的关键酶,当种子呼吸途径转为PPP时,意味着种子由休眠向萌发过程转变[21-22]。本研究中,处理Ⅴ时期红花绿绒蒿种子PK活性较未层积种子(CK)显著降低(P<0.05),SDH活性、G-6-PDH活性较未层积种子(CK)显著升高(P<0.05),意味着种子EMP途径减弱,TCA,PPP途径增强,呼吸代谢途径由EMP-TCA向PPP途径转变,种子休眠解除。此结果与羌活(Notopterygiumincisum)[23]、七叶一枝花(ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara)[24]、华重楼(ParispolyphyllaSmith var.chinensis)[25]种子研究结果类似,且与休眠种子呼吸代谢酶被抑制的观点一致[26]。

3.4 红花绿绒蒿种子休眠解除与内源激素的关系

多种植物激素参与调控种子休眠与萌发[27-28],其中ABA和GA行使主要功能,ABA促进种子休眠,GA促进种子萌发[29],IAA通过调控ABA,GA的合成和传导影响种子的休眠及萌发[30],但有关IAA对种子萌发和休眠的影响还有一定争议,有研究表明IAA具有促进种子萌发的作用[31-33],但也有学者认为IAA与ABA存在协同作用从而诱导种子休眠[34]。本研究中,红花绿绒蒿种子ABA,IAA含量总体下降,发芽率显著上升(P<0.05),说明ABA,IAA含量下降促进种子休眠解除;GA3含量在处理Ⅲ至处理Ⅳ时期显著升高(P<0.05),同时期种子胚率快速增长,这可能与GA3大量合成有利于动员种子的储存物质和胚的扩张有关[35],随后GA3被消耗导致含量骤降,这与小花草玉梅(Anemonerivularisvar.floreminore)[36]、三七(Panaxnotoginseng)[37]等种子研究结果类似;GA1含量变化总体比较平稳,处理 Ⅰ 时期含量的上升可能与启动种子休眠调控进程有关。

种子休眠不仅取决于植物激素的绝对含量,还取决于激素之间的平衡和消长变化[38-39],GA与ABA的比值对种子休眠及萌发起主导作用[40],种子休眠随GA/ABA比例增大而解除[41-43]。本研究中,红花绿绒蒿种子ABA/GA3,ABA/GA1比值总体呈下降趋势,发芽率显著上升(P<0.05),说明GA/ABA比值正向调控红花绿绒蒿种子休眠的解除。

4 结论

红花绿绒蒿种子休眠解除是一个复杂的生理生化过程,随着层积时间的延长,种胚从球型胚、心型胚、鱼雷型胚,最终发育成子叶型胚,完成形态后熟;7℃ 20 d+4℃ 20 d+0℃ 20 d+-4℃ 20 d+4℃ 20 d的连续变温层积处理,是目前最佳的层积处理方案;种子内营养物质转化积累,呼吸代谢途径由EMP-TCA向PPP途径转变,ABA,IAA含量及ABA/GA3,ABA/GA1比值降低是红花绿绒蒿种子休眠解除的关键,且此过程与ABA调控密切相关。