接种根瘤菌对‘蒙农三叶草1号’结瘤固氮及生长的影响

曹克璠,刘嘉伟,索荣臻,张慧敏,马一鸣,吴 倩,刘 鑫,包立高,王明玖*

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院/草地资源教育部重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010018; 2.包头市农畜产品质量安全中心,内蒙古 包头 014010; 3.内蒙古自治区农牧业技术推广中心,内蒙古 呼和浩特 010030)

高加索三叶草(TrifoliumambiguumM.Bieb.)原产于高加索地区,具有发达的地下分蘖系统[4],平均根冠比为2.74,巨大的地下生物量为其提供了对各种环境条件的适应性[5]。高加索三叶草建植后,不仅产量高,还具有极好的营养品质,其粗蛋白含量高于紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、红三叶(TrifoliumpratenseL.)和白三叶(TrifoliumrepensL.),而纤维含量则比三者低[6]。然而,有研究学者发现高加索三叶草在非原产地的地区不能与根瘤菌形成共生关系,即使形成根瘤,大多数也是小且无效的[7]。‘蒙农三叶草1号’(T.ambiguumBieb. ‘Mengnong No.1’)是内蒙古农业大学培育出的高加索三叶草品种。该品种在内蒙古地区能正常建植,能够结瘤固氮。研究团队将其移栽至青海省西宁市及青藏高原等地后发现,‘蒙农三叶草1号’在青海地区仍然能够自发结瘤固氮。

‘蒙农三叶草1号’具有强大的抗逆性和环境适应性,使其能在内蒙古正常生长。但由于无法与根瘤菌共生固氮,其产量潜力和推广应用面临限制。目前,国内外对高加索三叶草的研究主要集中在三叶草育种[8-9]、耐寒性[10-11]、根蘖性[12]等方面,取得显著进展。但关于共生固氮机制的研究还相对薄弱。个别学者探讨了高加索三叶草特异性根瘤菌在新西兰南岛土壤中的持久性和有效性[13],但系统的根瘤菌筛选研究还不多。为充分发掘这一优质牧草资源的产量潜力和经济价值,亟需开展共生固氮方面的研究。

本研究采用盆栽试验,测试5株从青海地区分离得到的‘蒙农三叶草1号’根瘤菌菌株(No.1,No.2,No.3,No.5,No.9)对‘蒙农三叶草1号’的接种效果,比较不同菌株对三叶草结瘤固氮、生长和营养成分的影响,以筛选出最佳匹配根瘤菌菌株。该研究将有助于弥补该领域的研究空白,丰富高加索三叶草共生固氮机制的研究,并为推广应用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为内蒙古农业大学培育的‘蒙农三叶草1号’。

1.2 试验方法

1.2.1根瘤收集 取样区为青海大学试验田内的‘蒙农三叶草1号’种植区。将取样区平均分为3个小区,采用三点取样法,每区采样6份,共采集18份样品。采样时,铲去表土,下挖20～30 cm,将开花期的三叶草根系及粘附其上的根际土壤一同装入无菌冻存管,随后立即放进液氮罐中,带回实验室摘取其根瘤。

1.2.2根瘤菌分离、纯化 把采集的根瘤冲洗干净,选取个大、饱满、粉红色者,装入无菌瓶中。从无菌瓶中取出根瘤,用0.1%升汞浸泡5 min,再用95%的酒精浸泡1 min,最后用蒸馏水洗涤3次,确保无药剂残留。

将灭菌后的根瘤1～2个分别置于无菌培养皿中,用无菌镊子将其压碎,挤出汁液,加入2 mL无菌水稀释,充分混匀,制成菌悬液。取0.2 mL菌悬液于YMA培养基(甘露醇10 g,磷酸氢二钾0.5 g,硫酸钠0.2 g,氯化钠0.05 g,酵母膏0.4 g,RH微量元素液4 mL,琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL)上,并用灭菌玻璃棒涂抹均匀,放入28℃的恒温培养箱中培养。经过48 h的培养,在培养基上长出菌落。挑选生长良好的单菌落,在YMA培养基上反复划线,培养,直到得到纯化的菌株为止,待分离到较纯的单菌落后,将其分别转接于YMA斜面进行培养,4℃保存备用。

本研究共分离获得40株根瘤菌菌株。经过反复纯化培养,从中筛选获得发育良好的5株作为试验材料。

1.2.3BOX-PCR菌株基因分型

(1)PCR引物

用于根瘤菌基因组多样性的研究的BOX-PCR引物序列为BOXA1R 5′-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3′[14]。

(2)BOX-PCR扩增反应体系(25 μL体系)

反应体系中含10×PCR缓冲液 2.5 μL,MgCl2(25 mmol·L-1)5.6 μL,dNTP(10 mmol·L-1)2.0 μL,DMSO(100%)2.5 μL,BSA(10 mg·mL-1)0.2 μL,BOXA1R(30 pmol·L-1)引物0.32 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL,模板DNA(50 ng·μL-1)1.0 μL,用ddH2O补足至25 μL。

(3)PCR扩增条件

95℃预变性2 min;94℃变性1 min,52℃退火1 min,65℃延伸8 min,循环30次;最后65℃延伸18 min。PCR产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测后,置于-20℃保存备用。

(4)凝胶电泳检测

取BOX-PCR产物5 μL,加入1 μL的loading buffer,用1.5 %(W/V)的琼脂糖凝胶电泳(电压50 V)5 h。电泳结束后,放在凝胶成像仪进行扫描分析,保存。

1.2.4接种根瘤菌与幼苗培养

(1)菌悬液制备

将已经分离并鉴定后的根瘤菌分别接种至YMA液体培养基中,180 r·min-1,28℃摇床培养至光密度值(OD600值)>0.5时,10 000 r·min-1离心10 min,倒掉上清液用无菌水洗下菌体,配置成OD600值为0.5的菌悬液,备用。

(2)幼苗培养与处理

试验于2021年4月在内蒙古呼和浩特市内蒙古农业大学草原与资源环境学院草地资源教育部重点实验室人工气候室中进行。选取子粒饱满的‘蒙农三叶草1号’种子数粒,进行表面消毒。将消毒后的种子置于铺有滤纸的无菌培养皿中,26℃避光培养3～4 d。将发芽后的种子根部移栽至装满蛭石(已灭菌)的10 cm×10 cm的黑色营养钵中,置于28℃,16/8小时光照/黑暗循环、相对湿度70%的可控环境室中。每钵移栽3株,浇等量的Hoagland无氮营养液(NS1010-N-50L),培养1 d。在无菌条件下用移液枪将得到的菌悬液加入幼苗根部,每盆1 mL,每种菌株分别接50个营养钵作为重复。每盆每天定时补充10 mL营养液。

1.3 测定指标及方法

1.3.1植株表型的测定 在‘蒙农三叶草1号’接种不同根瘤菌处理60 d后,从各处理中随机选取10株植株。将植株从营养钵中取出,用蒸馏水冲洗根部表面残留的蛭石,滤纸吸干。以茎基部将植株分为地上部和根部,随后进行如下测定:

(1)用卷尺测定植株株高;

(2)用万分之一天平测定地上(地下)生物量鲜重(干重)、单株根瘤重;

(3)用镊子小心取下单株的所有根瘤,统计单株根瘤数量、单株有效根瘤数量等表型指标。

1.3.2植株营养成分测定 对接种60 d后的植株分别取样,在实验室内用滤袋技术改进的范氏测定法测定酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)和中性洗涤纤维(Neutral detergent fibre,NDF)含量[15],利用半微量凯氏定氮法测定粗蛋白(CP)含量[16]。

1.3.3根瘤固氮酶活性的测定 利用上海优选生物科技有限公司的植物固氮酶(Nitrogenase)ELISA检测试剂盒与酶标仪进行测定。

1.3.4根瘤的石蜡切片和观察 参考Li等[17]方法对筛选出的优势菌株的根瘤进行石蜡切片,并用甲苯胺蓝进行染色,将制好的片子置于莱卡生物显微镜下进行观察并拍照。

1.4 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2010 进行基础数据统计与处理,使用R 4.2.3软件对数据进行方差分析、相关性分析和主成分分析。

主成分分析和综合得分计算公式参考贺文君[18]的计算公式,公式如下所示:

Fi=U1X1+U2X2+U3X3+…+UiXi

(1)

F=F1W1+F2W2+F3W3+…+FiWi

(2)

式中,Ui表示第i主成分的得分系数,Xi表示各指标标准化后数据,Fi表示各主成分得分,Wi表示各主成分因子的贡献率,即第i主成分权重,F表示主成分综合得分。

2 结果与分析

2.1 菌株的基因分型

本研究采用BOX-PCR技术对分离得到的菌株进行基因分型,从BOX-PCR扩增结果可以看出,所有菌株之间均有差异,表明这5株根瘤菌属于不同的菌株(图1)。

图1 BOX-PCR扩增结果Fig.1 BOX-PCR amplification results注:图中M为100 bp Marker,1为No.1,2为No.2,3为No.3,4为No.5,5为No.9。下同Note:In the figure,M is 100 bp Marker. 1 stands for No.1 strain;2 No.2 strain;3 No.3 strain;4 No.5 strain and 5 No.9 strain. The same as below

2.2 植株生长表型分析

2.2.1接种根瘤菌对植株株高的影响 在接种不同根瘤菌菌株的处理下,各组植株的株高均较CK显著差异(P<0.05),1,2,3,5和9号菌分别提高了53.28%,25.61%,45.02%,169.78%和71.00%。说明接种根瘤菌能够促进植株株高增长。其中,效果最佳的为接种5号菌的处理,株高为22.23 cm(图2)。

图2 接种不同根瘤菌菌株对‘蒙农三叶草1号’株高的影响Fig.2 Effect of inoculation of different Rhizobium strains on the plant height of ‘Mengnong Clover No. 1’注:图中数据(平均值±标准差)带有不同字母者代表处理间差异显著(P<0.05)。下同Note:Data (mean ± standard deviation) with the different lowercase letters in the graph represents a significant difference between different treatments at the 0.05 level. The same as below

2.2.2接种根瘤菌对植株单株生物量的影响 各组植株的单株生物量的增减幅度各异。在地上生物量鲜重的比较中,各组生物量数值均显著大于CK(P<0.05),最大的为接种5号菌的处理,达到了3.268 g;1,2,3和9号菌的处理也较CK分别提高了1.74,1.21,3.37和2.35倍(图3a)。烘干至恒重后,地上生物量的整体变化趋势并无较大波动,但仍差异显著(P<0.05),由大到小依次为5,3,9,1和2号菌的处理,较CK分别增长了132.56%,11.63%,255.81%,1 704.65%和216.28%(图3c)。在地下生物量鲜重的比较中,效果最突出的是接种5号菌的处理,地下生物量鲜重达到了2.284 g;效果最差的为接种2号菌的处理,较CK降低了34.88%,地下生物量鲜重仅为0.168 g(图3b)。地下生物量干重与鲜重的变化幅度大致相同,效果最好的依旧为接种5号菌的处理,地下生物量干重为0.467 g(图3d)。

图3 接种不同根瘤菌菌株对‘蒙农三叶草1号’生物量的影响Fig.3 Effect of inoculation of different rhizobium strains on the biomass of ‘Mengnong Clover No. 1’

2.2.3接种根瘤菌对植株单株根瘤指标的影响 由于CK未进行接种处理,无法结瘤固氮,故其根瘤指标均为0。1,2,3和9号菌处理的根瘤数平均值分别为23.7,22.4,28和23.6,而接种5号菌的植株,显著大于其它处理(P<0.05),平均值高达45.9(图4a)。通过肉眼观察根瘤的外部形态,其中个大、饱满、粉红色者,视为有效根瘤,1,2,3,5和9号菌的有效根瘤率分别为78.06%,69.64%,75.71%,73.86%和86.44%(图4b)。可以看出,尽管接种5号菌的处理会产生更多的根瘤,但其有效率并不高,而接种9号菌的处理所产生的有效根瘤较多。接种1,2和3号菌的处理之间,单株的根瘤重无显著差异,平均值分别为0.012 g,0.011 g和0.012 g;接种9号菌处理的显著高于这3个处理(P<0.05),平均值为0.017 g;而平均值最大的是接种5号菌的处理,平均值为0.029 g(图4c)。

图4 接种不同根瘤菌菌株对‘蒙农三叶草1号’根瘤指标的影响Fig.4 Effect of inoculation of different rhizobium strains on the root nodule indexes of ‘Mengnong Clover No. 1’

2.3 接种根瘤菌对植株营养成分的影响

接种根瘤菌60 d后进行取样,测定其不同纤维指标的含量,不同处理间的NDF含量变化范围为25.339%～39.05%;其中未接种根瘤菌的植株NDF最高,为39.05%,显著高于其他处理(P<0.05);接种根瘤菌处理下的植株NDF含量在30%左右,其中含量最低的为接种5号菌的处理,含量为25.339%,与其他处理均存在显著性差异(P<0.05)(图5a)。对于ADF,不同处理间的ADF含量变化范围为19.437%～28.25%;其中未接种根瘤菌的植株ADF最高,为28.25%,显著高于其他处理(接种3、9号菌的处理除外)(P<0.05);而含量最低的为接种5号菌的处理,含量为19.437%。通过计算得出的RFV中,数值最高的为接种5号菌的处理,高达270.86%,显著高于其他处理(P<0.05);而数值最小的是未接种根瘤菌的处理,显著低于其他处理(P<0.05)(图5b)。

图5 ‘蒙农三叶草1号’接种不同根瘤菌菌株后对其营养成分的影响Fig.5 Effect of inoculation of different rhizobium strains on the nutrient composition of ‘Mengnong Clover No. 1’

图6 不同根瘤菌菌株的根瘤固氮酶活性测定Fig.6 Determination of nitrogen fixing enzyme activity of different rhizobia strains

不同菌株处理下,植株粗蛋白质含量变化明显,接种根瘤菌的处理均显著提高了植株的粗蛋白含量(P<0.05)。其中,效果最好的是接种1、5、9号菌株的植株,粗蛋白含量较CK分别增加了38.52%,37.99%和36.91%;其次为接种2、3号菌株的处理,粗蛋白含量较CK分别增加了25.37%和26.87(图5c)。

2.4 根瘤固氮酶活性的测定

接种根瘤菌处理后的植株均发生了结瘤现象。从根瘤的固氮酶活性强弱来看,最弱的为接种1号菌的处理,为7.30 μmol·(g·h)-1;接种2号菌的处理为1号菌的1.219倍,且存在显著性差异(P<0.05);接种5号菌的处理,较1号菌增长了25.5%;9号菌的处理略高于1号菌的处理,为7.71 μmol·(g·h)-1。而接种3号菌的处理显著高于其他处理(P<0.05),达到了10.21 μmol·(g·h)-1;各处理组的固氮酶活性均存在显著性差异(P<0.05)。

2.5 优势根瘤的显微结构观察

为观察根瘤内部结构,对优势菌株(5号菌)根瘤横、纵切面的显微结构进行观察。根瘤内部甲苯胺蓝的染色较深而且着色面积较大,这就表明了根瘤菌在根瘤细胞中定殖较多且被侵染的根瘤细胞数目也较多(图7)。

图7 接种5号根瘤菌菌株植株的根瘤横(左图)纵(右图)切面Fig.7 Transverse (left panel) and longitudinal (right panel) sections of the root nodule from plants inoculated with the rhizobium strain No.5

图8 ‘蒙农三叶草1号’接种不同根瘤菌菌株后对各指标影响的相关性热图Fig.8 Heat map of correlation between the individual indexes in ‘Mengnong Clover No.1’ inoculated with different rhizobium strains注:*,**和***在此表示不同的显著性水平,分别对应P值小于0.05,0.01和0.001Note:*,** and *** here represent different levels of significance,corresponding to P-values less than 0.05,0.01 and 0.001,respectively

2.6 接种根瘤菌对植株各指标影响的相关性分析

采用皮尔逊相关性分析方法,分析了株高、单株生物量、根瘤指标、营养成分等变量之间的线性相关性。结果显示:

(1)株高与单株地上鲜/干重(r=0.95,P<0.01;r=0.96,P<0.01)、单株地下鲜/干重(r=0.94,P<0.01;r=0.94,P<0.01)、根瘤数(r=0.95,P<0.01)、有效根瘤数(r=0.93,P<0.01)呈显著正相关;与单株根瘤重的正相关更为显著(r=0.98,P<0.001)。这符合株高与植株生长量之间应存在的正相关规律。与粗蛋白(r=0.65)、固氮酶活性(r=0.49)呈正相关关系但不显著。

(2)NDF(r=-0.91,P<0.05)和ADF(r=-0.88,P<0.05)与株高呈显著负相关。与根瘤数量、有效根瘤数、单株根瘤重呈极显著的负相关关系(P<0.01)。

(3)ADF与单株地上鲜/干重(r=-0.87,P<0.05;r=-0.88,P<0.05)、单株地下鲜/干重(r=-0.89,P<0.05;r=-0.90,P<0.05)、根瘤数量(r=-0.89,P<0.05)、有效根瘤数(r=-0.83,P<0.05)、单株根瘤重(r=-0.87,P<0.05)均呈显著负相关。

2.7 接种根瘤菌对植株各指标影响的主成分分析

将接种根瘤菌后的各指标进行归一化处理,提取了特征值大于1的2个主成分,其方差贡献值分别是86.2%和11.1%,累计方差贡献率是97.3%,说明提取的2个主成分解释了接种根瘤菌对植株表型、营养成分的大部分积极的影响。因此,提取2个主成分,分别为y1和y2。

根据2个主成分系数,得到y1,y2的线性组合:

y1=0.305X1+0.299X2+0.293X3+0.302X4+0.297X5+0.306X6+0.302X7+0.310X8-0.308X9-0.276X10+0.236X11+0.212X12

y2=-0.092X1-0.276X2-0.337X3-0.290X4-0.321X5+0.192X6+0.215X7+0.098X8-0.185X9+0.129X10+0.458X11+0.510X12

由上式可知,在主成分y1中,株高(X1)、地上鲜重(X2)、地上干重(X4)、根瘤数量(X6)、有效根瘤数(X7)、根瘤重(X8)的系数绝对值大于其他变量的系数绝对值,所以主成分y1是植株地上部分及根瘤指标的综合反映,它表示植株的地上生长和根瘤发育状况。

在主成分y2中,地下鲜重(X3)、地下干重(X5)、粗蛋白(X11)、固氮酶活性(X12)的系数绝对值大于其他变量的系数,所以主成分y2主要是由这4个指标来综合反映的,它表示植株地下部分发育状况、营养成分及固氮酶活性等。

主成分分析进一步证实,接种5号菌的处理显著提高了植株的研究属性(图9)。

图9 ‘蒙农三叶草1号’接种不同根瘤菌菌株后对各指标影响的主成分分析可视化图Fig.9 Principal component analysis of the effects of inoculation of different rhizobium strains on each indexes in ‘Mengnong Clover No.1’

3 讨论

3.1 接种根瘤菌对植株生长与结瘤的影响

在自然界中,由豆科牧草和根瘤菌组成的共生系统被认为是最有效的固氮系统之一[18-20]。大量研究表明,豆科牧草通过接种根瘤菌可以有效提高饲草产量和质量[21-22],接种根瘤菌的植株可以产生有效的根瘤,从而改善作物生长性能,促进根系发育,提高单株根瘤数和根瘤鲜干重[24]。

株高是描述牧草基本生长状况,反映牧草产量的重要指标之一[25]。在本试验中,接种根瘤菌后的植株株高较CK明显提高。这一结果与前人的研究结果相一致[26]。高振生等[27]通过比较不同根瘤菌处理的苜蓿生物量,发现接种根瘤菌比不接种根瘤菌处理能显著提高植株高度;罗彦昕[28]对紫花苜蓿‘公农一号’和‘金皇后’2个品种进行接种根瘤菌的研究发现,‘公农一号’‘金皇后’接种根瘤菌后,株高较CK增加28.92%和39.24%;而姬月梅等[29]在根瘤菌/大豆(Glycinemax(L.) Merr.)匹配试验中发现,相比对照组,接种根瘤菌后的大豆的株高反而降低。导致结果不同的原因可能有以下几点:首先,试验材料不同,本研究使用的‘蒙农三叶草1号’与其它研究的紫花苜蓿等基因型不同,对根瘤菌的响应可能存在差异;其次,根瘤菌菌株不同,与植物基因组匹配程度的高低会影响促生长效果。另外,在本研究中,5号菌处理的促生长效果最佳,这可能是因为5号菌株与‘蒙农三叶草1号’匹配性高,进行了高效氮固定,为植株提供足够多的氮素。同时,5号菌株还可能合成并分泌了更多促生长激素,如脱落酸、赤霉素等植物生长激素,促进植株生长。

牧草干鲜比是指牧草鲜草风干样品重量占牧草鲜草重量的百分比,可以反映牧草干物质的积累和利用程度,用来揭示牧草干物质积累的基本情况,同时作为判定牧草是否能够用于青贮的依据[30]。接种根瘤菌可显著提高植株的地上/地下生物量,这与宋珍、王广达等人的研究结果相似[29-30]。一种原因可能是,在接种根瘤菌初期,植株还未出现结瘤现象,向植株施加缺氮营养液,造成植株的营养匮乏,而随着根瘤的出现,空气中的N2被其固定,为植株提供营养,植株得以迅速生长,造成植株生物量的增加;另一方面,接种根瘤菌后,植株通过促进根系的生长和发育,为根瘤菌提供更多的位点,造成植株地下生物量的增加。这与诸多研究学者的结论类似,如黄新等研究了接种根瘤菌对不同苜蓿品种结瘤和生物学产量的影响,结果发现,接种匹配的根瘤菌能显著提高紫花苜蓿的生物学产量[21]。

研究结果表明,接种根瘤菌后,豆科植物通过特定的识别和相互作用形成具有固氮能力的根瘤,以改善豆科植物的生长性能,促进根系发育,提高单株根瘤数和根瘤的鲜干重[24,29]。本试验中,尽管5株根瘤菌菌株都能与‘蒙农三叶草1号’形成共生,进行结瘤固氮,这与Mitchell等[2]的研究结果相似。但固氮和促进植物生长效果存在明显差异,这与胥雅馨等[33]及Matse等[34]的研究结果一致。其中5号菌株的促生长效果最佳,表明不同根瘤菌对特定植株的适配性不同,筛选匹配的菌株对获得最佳效果至关重要。本研究初步确定5号菌株为‘蒙农三叶草1号’的最适匹配菌,为后续大面积应用奠定了基础。

本研究采用蛭石固定植株且经过灭菌处理,配合缺氮营养液,可有效隔离外部氮源的影响,保证根瘤固氮作为植株唯一氮源,这种技术措施对准确评价根瘤菌效应提供了支持。今后的研究可在自然土壤环境中验证各菌株的效果。

3.2 接种根瘤菌对植株营养价值的影响

纤维素含量是影响牧草品质的重要指标。通常认为纤维素含量越低,牧草的营养价值就越好[35]。韩华雯等[34-36]的研究结果显示,接种根瘤菌可以降低苜蓿中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量。本研究也得到了类似的结论,根瘤菌处理可显著降低‘蒙农三叶草1号’植株的NDF和ADF含量,增加蛋白质含量。原因可能有以下几个方面:首先,在根瘤菌-豆科植物共生系统中,根瘤固定大气中的N2,并将其转化为可被生物体直接利用的形式,此过程需要消耗大量的能量,作为碳水化合物如可溶性糖可直接转化为能量供其利用,而粗纤维作为一种结构性碳水化合物,也极有可能被消耗,因而导致植物干草中粗纤维含量的下降。其次,根瘤菌固氮作用提供氮源,促进植株氮代谢,合成更多氨基酸和蛋白质,从而提高蛋白质含量。

但是,曾长立等[21,37],的研究表明,接种根瘤菌也可能提高植株纤维含量。这可能是由于测试材料、根瘤菌菌株、试验条件等的差异导致了研究结果的不一致。本研究发现5号菌株处理效果最佳,可显著降低‘蒙农三叶草1号’的NDF和ADF,增强饲料品质。这为筛选适配‘蒙农三叶草1号’的功能菌株,改善草料质量提供了依据。今后还需在更多环境下验证不同根瘤菌对‘蒙农三叶草1号’营养成分的影响。

4 结论

对‘蒙农三叶草1号’接种不同根瘤菌菌株,均会改善植株的生长表型,营养成分等指标。其中,5号菌株效果最佳,可显著提高植株株高、地上地下生物量,降低ADF,NDF含量,增加蛋白质含量。根瘤的固氮酶活性测定表明,3号菌株酶活性最强,其次是5号菌株。根瘤结构观察显示,在5号菌株中,根瘤菌定殖较多且侵染的根瘤细胞数目也较多。本研究初步筛选出促进‘蒙农三叶草1号’生长的功能根瘤菌株,为后续应用研究奠定了基础。