谢贤运,冯常辉,王孝刚,夏松波,张教海,张友昌,王琼珊,秦鸿德,别墅
(湖北省农业科学院经济作物研究所/ 农业农村部长江中游棉花生物学与遗传育种重点实验室,武汉 430064)
棉花是喜温作物,但在生长过程中对高温仍然比较敏感,尤其是在现蕾后到吐絮前遭遇高温会导致蕾铃脱落增加,单株成铃数减少,铃重降低,纤维品质下降[1]。 棉花现蕾、开花及吐絮的最适温度为30 ℃,35 ℃及以上高温影响会棉花生长发育[2]。随着全球气候的变暖,极端天气频繁出现,高温胁迫对棉花生产的危害越来越严重。 有研究表明,进入21 世纪以来,我国西北内陆、黄河流域和长江流域三大棉区的夏季极端高温日数都有逐年增加的趋势,其中长江流域棉区夏季极端高温日数的增加趋势更为明显[3-6]。
一般认为,高温胁迫会导致叶绿素生物合成受损,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)活性下降,丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增加,膜系统受损,细胞渗透压变化,1,5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)活性降低[7],光系统Ⅱ(photosystemⅡ,PSⅡ)的能量转移和电子传递受阻,光合能力下降[8]。对棉花生殖器官而言,高温胁迫会导致与花粉育性相关的基因异常表达,扰乱活性氧代谢和能源物质代谢,降低棉花花药开裂程度和花粉活力,甚至造成花粉败育[9-10],影响授粉、受精,降低单株成铃数和铃重,造成籽棉产量和纤维品质下降[11-12]。
在高温胁迫期间,应用外源植物生长调节剂是提高作物耐高温能力的重要途径。 作为一类植物生长调节物质,茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)在植物抵抗逆境的过程中发挥着重要作用。 在逆境胁迫下施用外源MeJA 可以提高相关抗氧化酶活性和脯氨酸含量,降低MDA 含量,维持细胞正常的渗透压, 增加气孔导度和光合速率,提高水稻、小麦、玉米等作物的耐旱、耐盐和抵抗低温或高温逆境的能力[12-20]。 外源MeJA 可以增强棉花种子在盐胁迫下的萌发能力,在干旱及盐胁迫下促进棉苗生长[21-22]。 在水稻孕穗期和灌浆早期喷施MeJA 能显著提高水稻产量和籽粒品质[14,23]。此外,在小麦[24]和拟南芥[25]中,茉莉酸(jasmonic acid,JA)的合成或信号转导受阻,会造成花药不开裂和花粉发育异常, 而外源施加MeJA 后可以提高或恢复花粉育性。 对一些光温敏不育的水稻[26-29]和小麦[30]材料,通过外源施加MeJA 也能够提高花粉育性、 花药开裂率和开颖率,从而提高自交结实率。最近研究也证实JA 的合成不足与棉花高温不育有密切联系,施用外源MeJA 能恢复JA 合成缺陷突变体的花粉育性[31-32]。
已有研究表明外源MeJA 可提高植物对逆境的耐受能力,但施用外源MeJA 能否增强花铃期棉花对高温胁迫的耐受能力,减少高温逆境对产量和纤维品质的负面影响未见相关报道。 本研究拟通过对喷施不同浓度MeJA 的花铃期棉株进行高温胁迫处理,研究外源MeJA 对花铃期棉花耐热性状以及产量和纤维品质的影响,为利用生长调节物质提高棉花耐高温性能提供理论依据。
试验材料为湖北省农业科学院经济作物研究所选育的常规棉品系ZS08, 该品系具有生长势强、开花集中的特征,为无限果枝类型。2021 年采用盆栽和大田直播相结合的方式,分别种植于湖北省农业科学院盆栽场和南湖试验基地。 盆栽试验材料置于室外, 高温胁迫前, 生长环境无35.0 ℃以上的高温。 直播材料于5 月20 日采用随机区组设计进行种植,设置3 次重复。 共12 个小区,小区面积26.7 m2,株距0.33 m,行距0.80 m,密度37 500 株·hm-2。试验田土壤肥力中等,地势平坦,试验期间无旱涝,栽培管理措施同大田。
高温胁迫采用人工高温胁迫和大田自然高温胁迫2 种方式进行。 人工高温胁迫试验是在盆栽棉花约70%植株开花后,从中选择长势一致的植株移入人工气候箱,常温(昼温28 ℃/ 夜温20 ℃)环境中生长7 d 后进行连续3 d 的高温(昼温38 ℃/ 夜温30 ℃)胁迫(高温胁迫处理的第1天记作0 d)。 高温胁迫的温度设置为每天7:00-9:00 温度从夜温逐渐升高至昼温,17:00-19:00从昼温逐渐下降至夜温。气候箱光照条件设置为光周期12 h,光照时间为7:00-19:00,光照强度1 200 μmol·m-2·s-1。高温胁迫3 d 后将植株移出气候箱,恢复正常管理。 盆栽材料在人工气候箱以及室外生长期间,每隔3 d 浇1 次水,使土壤保持湿润状态。
自然高温胁迫试验中, 利用电子温度计每2 h 记录1 次田间温度。 试验地自7 月30 日起进入高温期,持续至8 月8 日,其间每天昼均温度为35.2~37.5 ℃, 夜均温度为26.4~27.8 ℃(图1)。
图1 试验小区气象条件Fig.1 Weather condition at the experimental field
设置3 个浓度200μmol·L-1、400μmol·L-1及600 μmol·L-1MeJA 处理(分别记为T1、T2 和T3)和蒸馏水(CK)对照。 在人工高温胁迫试验中,于高温胁迫前1 d 对植株喷施1 次,每个处理的单株喷液量为10 mL。 每个人工气候箱放置8盆材料,每盆2 株,同一人工气候箱内的材料采用同一浓度的MeJA 处理。 自然高温胁迫试验中,在8 月1 日对试验小区的棉花进行1 次喷施处理,用液量为375 L·hm-2(每株约10 mL)。
1.4.1花粉活力测定。 对人工高温胁迫的植株进行花粉活力测定。 从高温胁迫处理当天(0 d)开始,每天9:00-11:00 从每个处理选取3 株棉花,每株选取1~2 朵当日开放的花, 采集花粉装于1.5 mL 离心管中,连续取样10 d(分别记为0~9 d)。向装有花粉样品的离心管中加入1 mL 氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液,置于37 ℃培养箱中染色30 min,在普通光学显微镜(×100)下观察花粉活力。 有活力花粉被染为深红色,活力衰退或部分丧失的花粉染色较浅或局部被染色, 无活力花粉不染色。 每朵花镜检300 粒以上花粉,分别统计深红色、浅红色/ 局部染色、不染色的花粉粒数,按以下公式计算每株的活力花粉百分数:
活力花粉百分数=(深红色花粉数+浅红色或局部为红色花粉数/2)/总花粉数×100%。
1.4.2光合生理指标测定。 对人工高温胁迫下的材料进行光合生理指标测定。 从高温胁迫当天(0 d)至历经高温3 d 后(3 d),每天上午9:00-11:00 用CIRAS-3 光合仪测定各处理棉株主茎倒四叶的净光合速率(net photosynthetic rate,Pn)、蒸腾速率(transpiration rate,Tr)、气孔导度(stomatal conductivity,Gs)和胞间二氧化碳浓度(intercellular carbon dioxide concentration,Ci)。每个处理选取3株棉花,每株棉花测定3 次。 测定光合生理指标时,光合仪使用开放式气路和内置光源,光照强度为1 200 μmol·m-2·s-1。
1.4.3叶片抗氧化酶活性与MDA 含量测定。 对人工高温胁迫下的材料进行叶片抗氧化酶活性与MDA 含量测定。 从高温胁迫当天(0 d)至高温处理3 d 后(3 d),每天上午9:00-11:00 每个处理选3 个棉株,取倒二叶保存于-80 ℃冰箱中待测。 用南京建成生物工程研究所的总超氧化物歧化酶测定试剂盒(WST-1 法)、过氧化物酶测定试剂盒(测植物)(比色法)、丙二醛测定试剂盒(微板法) 测定叶片的SOD 活性、POD 活性及MDA含量。
1.4.4棉花产量、纤维品质性状测定。 于2021 年8 月2 日至8 月8 日(共7 d)对小区中当天开放的花朵进行连续挂牌标记(8 月8 日后因连续下雨,未继续进行挂牌),每个小区每天随机挂牌30朵。吐絮后按小区采收挂牌棉铃,并计算铃数。籽棉样品经烘箱烘干称量, 得到挂牌花籽棉质量,考察挂牌花的成铃率、铃重、不孕籽率,小区挂牌花籽棉轧花后得到皮棉质量折算皮棉产量并计算衣分。 每个小区取棉样20 g,送至农业农村部棉花品质监督检验测试中心测定纤维上半部平均长度、长度整齐度指数、断裂比强度、马克隆值和断裂伸长率5 项指标。 挂牌花的成铃率、铃重、不孕籽率、衣分计算方法为:成铃率=挂牌花总成铃数/ 挂牌花总数×100%;铃重=挂牌棉铃籽棉总质量/挂牌花总成铃数;不孕籽率=(挂牌棉铃不孕籽粒数/ 挂牌棉铃全部籽粒数)×100%;衣分=(挂牌棉铃皮棉总质量/ 挂牌棉铃籽棉总质量)×100%。
采用GraphPad Prism 9 和Microsoft Excel 2016 软件进行数据分析并作图, 采用双因素(MeJA 处理浓度和高温胁迫时间)方差分析对花粉活力、光合作用指标以及POD 活性、SOD 活性和MDA 含量数据进行处理, 采用单因素(MeJA处理浓度)方差分析对产量和纤维品质性状数据进行分析,并用最小显著差数法(least significant difference,LSD)进行多重比较。
经2 d 的高温胁迫后,CK 花粉活力自3 d 时开始逐渐下降,6 d 时的花粉活力较0 d 显著下降,7 d 时降至最低,6 d 与7 d 时差异不显著,花粉活力仅有36.4%和33.3%,8 d 开始花粉活力逐渐上升,9 d 时恢复至78.0%(表1)。 表明高温胁迫对花粉活力造成影响是发生在开花之前的蕾发育阶段,开花前6~8 d 的蕾受到高温胁迫后,花粉活力受显著影响,且开花前6~7 d 的蕾受影响最大。
表1 高温胁迫下不同MeJA 处理棉花花粉活力的变化Table 1 Variation of pollen viability of cotton under heat stress in different treatments of MeJA%
MeJA 处理棉株的花粉活力随时间变化的趋势与CK 相同,但受高温胁迫影响的程度明显降低。 喷施MeJA 处理的花粉活力受高温胁迫影响最严重的时间段是6~7 d,各MeJA 处理的花粉活力较CK 显著提高25.8~32.3 百分点。 在花粉活力受高温胁迫影响次严重的8 d, 各MeJA 处理的花粉活力较CK 显著提高21.2~22.9 百分点。 在其余时间点,各MeJA 处理的花粉活力与CK 处于同一水平,无显著差异。 以上数据表明,施用外源MeJA 可以显著恢复受高温胁迫而降低的花粉育性。
与高温胁迫刚开始时(0 d)相比,高温胁迫后CK 的Pn、Tr、Ci和Gs均有显著变化, 除Tr在3 d较0 d 小幅度降低外,其余指标均升高(图2),说明试验材料具有一定的耐高温性能。 比较各处理在经受不同时间高温胁迫后的光合参数变化发现,CK 与MeJA 处理的Ci随高温胁迫时间的延长而逐渐上升,除T2(400 μmol·L-1MeJA)处理在2 d 和3 d 显著高于CK 外,CK 与MeJA 处理的Ci无显著差异(图2C)。在各时间点上,不同处理间Ci的差异均较小, 表明Ci受MeJA 的影响较小。在高温胁迫下,MeJA 处理的Pn、Tr和Gs除在1 d 差异较CK 不显著外,在其余时间点上,MeJA 显著影响叶片的Pn、Tr和Gs。 在高温胁迫开始时(0 d),不同MeJA 处理的Pn和Tr均显著低于CK,T3(600 μmol·L-1MeJA)处理的Gs显著低于CK。 在2 d,200 μmol·L-1MeJA(T1)处理的Gs显著高于CK,T2 和T3 处理的Pn、Tr和Gs均显著高于CK。 历经高温胁迫3 d,T1 处理的Pn、Tr和Gs与CK 均无显著差异;T2 处理的Pn、Tr和Gs显著高于CK;T3 处理的Tr和Gs显著高于CK,Pn高于CK 但差异不显著。 2~3 d 中T2、T3处理的Pn、Tr和Gs与CK 相比增幅分别为1.6%~3.7%、7.2%~15.7%和44.4%~53.4%。
图2 花铃期喷施MeJA 对高温胁迫下棉花光合参数的影响Fig.2 Effects of spraying MeJA during flowering and boll-setting stage on photosynthetic parameters of cotton under heat stress
在高温胁迫后的不同时间点,MeJA 处理的Pn、Tr和Gs变化幅度均大于CK。 较高温胁迫开始时(0 d),不同MeJA 处理的Pn和Tr上升幅度的趋势较为一致, 从高到低依次为T2、T3 和T1处理。MeJA 处理间的Gs较对照上升幅度从高到低依次为T3、T2 和T1 处理。
棉花经受高温胁迫后,对照和MeJA 处理下倒二叶的SOD 活性均随胁迫时间的延长而上升(图3A)。高温胁迫下,MeJA 处理的SOD 活性高于CK, 但仅在3 d 时SOD 活性显著高于对照。受高温胁迫后,T2 处理的SOD 活性在1~3 d 较0 d 的上升幅度均高于对应时间点的CK,T3 处理在2 d 和3 d 的SOD 活性较0 d 的增幅均高于CK。 说明高温胁迫下,不同MeJA 处理与对照比较可以不同程度地提高棉花SOD 活性, 而且T2和T3 处理的增幅较大。
图3 花铃期喷施MeJA 对高温胁迫下棉花叶片SOD 和POD 活性的影响Fig.3 Effect of spraying MeJA during flowering and boll-setting stage on SOD and POD activity of cotton leaves under heat stress
高温胁迫对棉花叶片的POD 活性也造成明显影响, 对照与MeJA 处理的POD 活性经高温胁迫后总体呈下降趋势(图3B),但各MeJA 处理的POD 活性下降幅度低于对照, 且MeJA 浓度越高,POD 活性下降幅度越小。 高温胁迫起始时(0 d), 处理与对照的POD 活性差异不显著,在1 d 和3 d 时, 各MeJA 处理的POD 活性均显著高于CK;2 d 时, 仅T3 处理的POD 活性显著高于对照。 2~3 d 时,T2 和T3 处理的POD 活性较CK 提高5.70%~20.0%。
MDA 是膜脂过氧化的产物, 其含量变化是细胞膜系统是否受到氧化伤害的重要指标。 对照与处理的MDA 含量在高温胁迫1~2 d 时显著上升,在高温胁迫3 d 时下降(图4),说明对照和处理的棉花植株均受到高温胁迫带来的氧化伤害。 在高温胁迫开始(0 d)时,3 个浓度的MeJA处理的植株MDA 含量均略高于对照,1 d 时略低于对照,但均无显著差异;2 d 时,3 个浓度的MeJA处理的MDA 含量均显著低于对照,3 d 时各MeJA 处理的MDA 含量与对照无显著差异。 2~3 d 时,T2 和T3 处理的MDA 含量比CK 低10.9%~17.9%。 在历经高温胁迫后,3 种不同浓度MeJA 处理在各时间点的MDA 含量上升幅度均小于对照,表明不同浓度MeJA 处理均可减轻高温胁迫导致的氧化伤害。
图4 花铃期喷施MeJA 对高温胁迫下棉花叶片MDA 含量的影响Fig.4 Effect of spraying MeJA during flowering and boll-setting stage on MDA content of cotton leaves under heat stress
高温胁迫下,不同浓度MeJA 处理显著影响皮棉产量(表2),MeJA 处理浓度越高,皮棉产量增幅越大,200 μmol·L-1、400 μmol·L-1、600 μmol·L-1MeJA 处理的皮棉产量较对照分别增加9.0%、13.3%、18.3%。从产量构成因素来看,MeJA处理的成铃率显著增加; 除此之外,200 μmol·L-1和400 μmol·L-1MeJA 处理能降低不孕籽率、提高铃重,但与CK 差异不显著,600 μmol·L-1MeJA 处理则显著降低不孕籽率并显著提高铃重;MeJA 处理对衣分没有显著影响。从以上分析可以看出,MeJA 处理增加皮棉产量的主要原因是增加了成铃率和铃重,同时降低了不孕籽率。
表2 花铃期高温胁迫下MeJA 处理对棉花产量性状的影响Table 2 Effects of MeJA treatment on cotton yield traits under heat stress during flowering and boll-setting stage
除纤维上半部平均长度外, 不同浓度MeJA处理的挂牌棉铃的其他纤维品质指标(长度整齐度指数、断裂比强度、马克隆值和断裂伸长率)与CK 均无显著差异(表3)。400 μmol·L-1MeJA 处理的纤维上半部平均长度较CK 增加了1 mm,差异显著,600 μmol·L-1MeJA 处理的纤维上半部平均较CK 虽然也有所增加,但差异不显著。
表3 花铃期高温下MeJA 处理对棉花纤维品质的影响Table 3 Effects of MeJA treatment on cotton fiber quality under heat stress during flowering and boll-setting stage
棉花花粉发育对高温胁迫十分敏感,尤其在孢原细胞至小孢子释放早期、单核晚期至双核早期的2 个发育阶段对高温最为敏感[33-36],在此期间遭遇高温胁迫易导致花粉败育或花粉活力下降。 本研究发现,开花前6~8 d 遭受高温胁迫的花粉育性较未受高温胁迫的显著下降,喷施不同浓度的外源MeJA 后花粉活力得到显著恢复,提高幅度为41.7%~90.7%。 已有研究表明水稻不育系的花粉母细胞在减数分裂期的JA 含量与花粉败育有关[37],Khan 等[38]发现高温胁迫抑制棉花花药中JA 合成的关键基因GhAOC2的表达,减少JA 的生物合成, 并导致花药中活性氧的过度积累,导致雄性不育,且向处于发育早期的棉蕾连续喷施MeJA 可恢复热敏感材料的育性。 本研究进一步证实了上述结论,并发现高温胁迫前叶面喷施200~600 μmol·L-1MeJA 均可以较好地恢复花粉活力。
高温胁迫除影响花粉育性外,还会降低叶片Rubisco 的活性,破坏叶绿体内膜的稳定性,降低PS II 的能量转移和电子传递效率,抑制植物的光合作用[7-8],而高温胁迫下喷施MeJA 可提高叶片的Gs和Tr,显著降低水稻叶温的增幅,从而提高Pn[23]。 本研究中CK 的Pn从高温胁迫当天(0 d)至2 d 有所提高,这可能是与试验材料ZS08 具有一定的高温耐受性有关。 在非干旱高温胁迫下植物可通过增加Gs、Tr来调节叶片的温度[8,15,39],使叶温保持在Rubisco 活性适宜的温度, 同时高温胁迫下Ci的增加,也是导致Pn升高的因素之一[40]。高温胁迫2~3 d,400 μmol·L-1MeJA、600 μmol·L-1MeJA 处理下ZS08 叶片的Gs和Tr较CK 显著增加,Tr的显著提高可能是导致在高温胁迫2~3 d 后MeJA 处理叶片Pn较CK 增强的重要原因。 此外, 最近有研究表明, 在高温胁迫下MeJA 还可通过增强编码PS II 核心复合物蛋白psbA和psbB基因表达, 提高类囊体膜中的D1蛋白的稳定性并增加其丰度,提高电子输运的量子产率以及每个反应中心的电子输运通量[41]。 因此,推测适当浓度的MeJA 能提高高温胁迫下棉花Pn的机理可能是外源MeJA 能提高棉花叶片的Gs和Tr,降低叶温,保持Rubisco 的活化程度,并提高了PS II 的稳定性和效率。
高温胁迫会降低叶片的保护酶活性,加大膜脂过氧化程度,对植株产生伤害[42-43]。而喷施MeJA能减缓保护酶活性的下降幅度[7-8],达到与耐高温材料类似的效果[44]。本研究中,不同浓度MeJA 处理棉花叶片的SOD 活性提高幅度整体上高于对照,POD 活性下降幅度低于对照,MDA 含量增幅低于对照,表明喷施MeJA 有效缓解了高温对细胞的氧化伤害,与水稻中的研究结果一致[14,23]。 但在本研究中, 高温胁迫后对照的SOD 活性也升高。 这可能与高温处理时间及试验材料有关。 在胁迫刚发生时植物SOD 活性会被诱导增强,以清除体内活性氧; 高温胁迫持续一段时间后,造成的伤害超出了植物自身的调节范围,导致SOD活性下降。张英华等[45]对小麦旗叶的研究表明,在高温胁迫初期SOD 活性诱导增强, 之后随着高温的持续,其活性低于对照。 此外,水稻体内的抗氧化酶活性在不同品种、不同高温处理时间下变化趋势也有差异[14,46-47]。 许阳东[29]对水稻分别进行不同年份的高温处理,MeJA 与清水处理的POD活性随高温处理延长的变化趋势一致(先升高后下降)。 表明高温胁迫下作物在短时间内会有一个应激过程,但随着高温的持续进行,作物抗氧化酶活性便开始下降。 在本研究中,ZS08 可能同样也出现了类似应激过程, 高温当天POD 活性高于常温阶段(数据未显示)。
刘霞等[14]研究表明,100 μmol·L-1MeJA 可以降低水稻植株温度,缓解高温胁迫对植株生理生化过程的伤害,提高千粒重和结实率。罗直文[15]研究发现,28 ℃条件下,MeJA 处理可使水稻叶片光合速率增加,且高浓度(5 000 μmol·L-1)的效果好于低浓度(1 000 μmol·L-1)。 Fu 等[32]研究表明, 棉花体内JA 不足引起的花药闭塞可通过补充外源MeJA 来改变,500~1 000 μmol·L-1MeJA 处理的效果优于100 μmol·L-1MeJA。 但是目前还未见利用MeJA 提高棉花高温耐受性,达到增产效果的报道。本研究表明,400 μmol·L-1MeJA 和600 μmol·L-1MeJA 处理提高皮棉产量的效果较好,但是二者的皮棉产量无显著差异。
纤维发育受高温的影响, 而JA 以剂量和发育阶段依赖的方式影响胚珠和纤维的发育[48-49]。本研究中,不同浓度MeJA 处理的衣分与对照无显著差异, 且400 μmol·L-1MeJA 和600 μmol·L-1MeJA 处理对自然高温胁迫下的棉纤维长度具有一定促进作用。 前人在添加不同剂量JA 的培养基中培养棉花胚珠(开花前2 d),当JA 剂量较低时利于纤维起始发育[49],与本研究结果不一致,可能是田间试验的环境条件与体外胚珠培养不同造成,在培养皿中进行胚珠培养,更有利于细胞吸收JA。
基于当前数据,推测外源MeJA 可以提高棉花对高温胁迫的耐受能力,可用于减轻高温胁迫带来的产量损失,本研究为将来更加高效地应用外源MeJA 提高棉花产量和品质提供了基础,但相关研究仍需要深入或者改进。 例如,研究中发现MeJA 处理在高温胁迫起始(0 d)抑制光合作用,该现象在其他植物中也有报道[50],可能与编码放氧复合体外周蛋白的基因下调表达有关,但是否为同一原因尚不能确定, 有待进一步分析。在高温胁迫下喷施高于600 μmol·L-1MeJA 处理的效果也是未来研究的方向之一。 此外,受人工气候箱数量及单个气候箱容量的限制,每个处理植株数量有限,本研究未能对光合参数、相关酶活性、MDA 含量进行持续较长时间的观测,MeJA 对这些指标产生可持续影响的时间需要进一步深入探讨。
花铃期高温胁迫下,外源MeJA 处理可促进棉花花粉发育,提高花粉活力,同时提高叶片净光合速率,增加叶片抗氧化酶活性,降低MDA 含量,减轻高温胁迫对叶片的伤害,提高成铃率和铃重,增强棉花耐受高温胁迫的能力,减轻高温胁迫带来的产量损失。 研究发现400 μmol·L-1MeJA 和600 μmol·L-1MeJA 处理的棉株在高温胁迫下的皮棉产量比对照提高9.0%~18.3%,同时,纤维上半部平均长度和断裂比强度有所提高。