藏药鼠麴草的质量评价研究

杨锡金，刘翔，王云红，张小梅，舒抒，阳勇*，王计瑞**，钟国跃

（1.重庆市中药研究院 国家中医药管理局中药化学三级实验室／重庆市中药资源学重点实验室，重庆 400065；2.中国中医科学院 中药资源中心 重庆分中心，重庆 400065；3.遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563000）

鼠麴草为菊科（Asteraceae）植物鼠麴草（Gnaphalium affineD. Don）的干燥地上部分［1］，藏药名“干得巴渣”或“甘达巴扎”，收载于《藏药志》［2］、《中华本草（藏药卷）》［3］、《中国藏药》［4］、《西藏自治区藏药材标准》（2012年）［1］等藏医典籍及标准中。藏医理论认为鼠麴草具有祛风湿、消痞瘤的功效，常用于治疗“培根”病、痞瘤、痛风及风湿性关节炎等［1-2］。鼠麴草中主要含有黄酮类［5］、有机酸［6］、挥发油［7］及微量元素等［8］化学成分，其中黄酮类为主要活性成分［9-11］。现代研究表明，鼠麴草具有抗氧化［9］、改善气管炎［12］、保肝［13］及抗癌［14-15］等药理作用。鼠麴草资源蕴藏量丰富，在全国各地广泛分布，除了在藏区被藏医用于临床使用外，也被国内其他地区的地方标准所收载，作“鼠曲草”使用［16-19］。目前，汉藏地区各标准对鼠麴（曲）草的质量控制手段较简单，尤其是藏区（仅有性状、显微和薄层鉴别）［1］，难以保障质量稳定，严重影响了临床疗效的和生产发展。因此，本实验对鼠麴草进行水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物及含量测定等研究，结合化学计量学统计分析方法对其进行质量评价，以期为有效控制该药材的质量和完善相关地方标准提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

23批鼠麴草收集于2021年8月至9月，样品存放于重庆市中药研究院资源中心。经重庆市中药研究院刘翔研究员鉴定为菊科植物鼠麴草的干燥地上部分，具体信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.2 试剂与仪器

木犀草素（纯度：98.52%，批号：MUST-21072311）和芹菜素（纯度：98.03%，批号：MUST-22030615）均购于成都曼思特生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，批号：21045193，美国TEDIA），磷酸（色谱纯，批号：20211129，天津市科密欧化学试剂有限公司），其余试剂均为分析纯，购于重庆川东化工（集团）有限公司。

100 mm × 200 mm硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限公司）；100 mm × 200 mm薄层色谱展开缸（上海信谊仪器厂）；Waters e2695高效液相色谱仪、PDA检测器（美国沃特世公司）；UV 2600紫外分光光度计（日本岛津公司）；BS 224S 万分之一、CPA225D十万分之一电子天平（德国赛多利斯）；VGT-2013 QTD超声波清洗器（广东固特超声股份有限公司）；HH-ZK6恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；SX2-10-12Z智能一体式箱式电阻炉（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；UPR-Ⅱ-20L纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）。

1.3 TLC定性鉴别

1.3.1 对照品溶液制备

精密称取木犀草素和芹菜素适量，加甲醇制成浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液，即得。

1.3.2 供试品溶液制备

取供试品约0.5 g，精密称定，加入15 mL甲醇，超声处理15 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，即得。

1.3.3 鉴别方法

按照2020年版《中国药典》（以下简称“药典”）四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照品溶液1 μL、供试品溶液2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷 ： 乙酸乙酯 ： 甲酸（8 ： 6 ： 1）为展开剂，展开，取出后晾干，喷以1%三氯化铝试液，105℃加热，于365 nm紫外光灯下检视。

1.4 检查与浸出物

根据2020年版《中国药典》四部通则测定23批样品水分（0832第二法）、总灰分及酸不溶性灰分（2302）和浸出物（2201）。

1.5 含有量测定

1.5.1 色谱条件

Welch Ultimate® AQ-C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 µm）。流动相：甲醇（A） - 0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～ 45 min，47% A；45 ～ 47 min，47% ～ 90% A；47 ～ 55 min，90% A；55 ～ 57 min，90% ～ 47% A；57 ～ 65 min，47% A），流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温30℃，进样量10 µL。色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances（A） and test sample （B）

1.5.2 对照品溶液制备

精密称取木犀草素和芹菜素对照品适量，加甲醇制成含木犀草素0.749 mg/mL和芹菜素0.391 mg/mL的混合对照品溶液。

1.5.3 供试品溶液制备

取供试品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，0.22 µm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

2 结果与分析

2.1 TLC定性鉴别结果

23批样品的TLC鉴别结果见图2。由图可知，在供试品和对照品色谱相应位置上显相同的荧光斑点，而且图像清晰。

图2 木犀草素和芹菜素TLC色谱图Fig.2 TLC chromatograms of luteolin and apigenin

2.2 检查与浸出物结果

23批样品的检查与浸出物结果见表2。结果表明高海拔地区与低海拔地区的样品水分含有量分别在7.83% ～ 9.24%、8.25% ～ 10.70%之间，总灰分含有量分别在5.95% ～ 10.44%、9.04% ～ 17.11%之间，酸不溶性灰分含有量在0.83% ～ 4.39%、1.57% ～9.40%之间。浸出物含有量分别在22.03% ～27.43%、8.87% ～ 21.90%之间。

表2 水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物含有量测定结果Tab.2 Results of content determination of water， total ash，acid-insoluble ash and extracts

2.3 含有量测定

2.3.1 线性关系考察

取“1.5.2”项下对照品溶液，用甲醇梯度稀释，得到系列质量浓度的对照品溶液，过滤，在“1.5.1”项色谱条件下进样测定。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）做标准曲线，得到木犀草素和芹菜素的回归方程分别为Y= 31 282 680X-36 584（r= 0.999 9），Y= 26 449 515X- 35 086（r=0.999 4），在0.7 ～ 374.5 μg/mL和0.4 ～ 195.5 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验

取“1.5.2”项下对照品溶液在“1.5.1”项色谱条件下连续测定6次，测得木犀草素和芹菜素峰面积RSD分别为2.02%和2.45%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

精密称取1份供试品（SQC-16），按“1.5.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12和24 h在“1.5.1”项色谱条件下进样测定，测得木犀草素和芹菜素峰含有量RSD分别为1.16%和0.74%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验

精密称取同一批药材粉末（SQC-16）6份，按“1.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“1.5.1”项色谱条件下进样测定，测得木犀草素和芹菜素含有量RSD分别为2.72%和1.54%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收试验

精密称取含量已知的药材（SQC-16）6份，加入适量对照品，按“1.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“1.5.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。木犀草素和芹菜素的加样回收率范围分别在95.83% ～ 100.74%和93.48% ～ 102.04%之间，平均加样回收率分别为98.95%（RSD = 1.94%）和97.18%（RSD = 3.46%），符合药典规定。

表3 木犀草素和芹菜素加样回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests for luteolin and apigenin

2.3.6 样品含有量测定

取23批药材，按“1.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“1.5.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表4。结果表明，18批西藏地区和其他地区（3批市场和2批川西）收集的鼠麴草中木犀草素含有量分别为0.043 3% ～ 0.106 4%和0.026 2% ～0.063 3%，芹菜素的含有量分别为0.013 9% ～0.043 1%和0.015 6% ～ 0.047 4%；市场样品（除SQC-21外）中木犀草素和芹菜素的含有量比西藏地区样品的含有量低。

表4 木犀草素和芹菜素含有量测定结果Tab.4 Results of content determination of luteolin and apigenin

2.4 化学计量学方法分析

2.4.1 聚类分析

运用SPSS 20.0软件，以平方欧氏距离作为度量标准，以水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、木犀草素和芹菜素含有量6个指标为变量，进行标准化后，对23批样品进行系统聚类分析，共被分为4类，结果见图3。结果表明，绝大多数藏区的样品归为第Ⅰ类，市场收集及川西地区的样品分别分为Ⅱ类（SQC-21）、Ⅲ类（SQC-19、SQC-20和SQC-22）、Ⅳ类（SQC-23）。

图3 23批样品聚类树状图Fig.3 Dendrogram of 23 batches of samples

2.4.2 主成分分析

以浸出物、木犀草素和芹菜素含有量3个指标作为变量，特征值和累计贡献率作为判定依据，运用SPSS 20.0软件对23批鼠麴草进行主成分分析。根据降维结果，共挑选出2个主成分PC1和PC2，特征值分别为2.066和0.656，各成分方差贡献值分别为68.851%和21.873%，累积贡献值达到90.724%，代表性强，可以用来评价鼠麴草的质量。由表5可知，PC1主要反映浸出物、木犀草素和芹菜素的含有量信息，PC2主要反映芹菜素的含有量信息。

表5 各成分因子载荷矩阵Tab.5 Factor load matrices of various constituents

根据各因子载荷矩阵及特征值计算得分系数，进一步得到PC1和PC2方程式分别为PC1 = 0.631 ZX1+ 0.584 ZX2+ 0.734 ZX3，PC2 = -0.091 ZX1-0.307 ZX2+ 0.464 ZX3，其中ZX1、ZX2和ZX3分别为浸出物含有量、木犀草素和芹菜素含量的标准化值；综合得分Y= 0.688 PC1 + 0.219 PC2。利用上式计算各批鼠麴草质量综合得分并按结果进行排序，见表6，得分越高，样品的质量越优，排序越靠前。除SQC-1、SQC-2、SQC-4、SQC-6和SQC-13，绝大多数藏区样品排名比较靠前，其中SQC-7、SQC-10、SQC-11、SQC-14和SQC-16质量较优（综合得分大于0.9）；除SQC-21外，市场采购及川西地区的其他4批（SQC-19、SQC-20、SQC-22和SQC-23）排名在最后。主成分散点图见图4，西藏地区的样品与川西地区及市场采购的样品明显被区分。其中，西藏地区样品间差异较小，分布集中；川西地区及市场采购的样品分布较为分散，样品间差异性较大。主成分分析的结果与聚类分析整体一致。

图4 主成分分析散点图Fig.4 Scatter diagram of principal component analysis

表6 主成分得分及综合得分结果Tab.6 Results of pricipal component score and overall score

3 讨论

3.1 TLC

现行藏区标准中仅以鼠麴草对照药材作为对照［1］，但目前中检院系统中尚未有鼠麴草对照药材售卖，寻找时存在较大难度。其他省市（低海拔地区）的地方标准中鼠曲草多选用槲皮素作对照品［18-19］。经课题组前期研究发现，西藏地区产鼠麴草中的槲皮素含量低，在TLC中鉴别特征不明显，而木犀草素和芹菜素的含量则较高，也是药材中的主要药效成分。研究表明木犀草素能够通过抑制NLRP3炎性小体来保护类风湿性关节炎大鼠的骨关节［20］，木犀草素和芹菜素具有治疗痛风的作用［21-22］，这与鼠麴草“治疗痛风及风湿性关节炎”的作用相一致，因此选择这2种活性成分作为TLC的对照品。

另外，在按照现行藏区标准中展开系统［环己烷 ： 乙酸乙酯（8 ： 2）］展开时未能显现出木犀草素和芹菜素的斑点特征。经过对展开系统的优化，最终选择了图谱清晰、专属性强、重复性好、分离度高的环己烷 ： 乙酸乙酯 ： 甲酸（8 ： 6 ： 1）作为展开剂。同时，本研究进一步优化了供试品溶液的制备方法，分别考察了提取溶剂（甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯和丙酮）、提取时间（10、15和20 min）和料液比（1： 20、1： 30和1： 40）的影响，最终选用甲醇为溶剂，料液比为1 ： 30，超声15 min作为制备TLC供试品溶液的最佳方法。此外，还考察了包括展开距离、不同来源薄层板、展开环境在内的方法耐用性。结果表明，该方法耐用性良好，可用于鼠麴草药材中木犀草素和芹菜素的定性鉴别。

3.2 检查项

本研究发现，不同来源的鼠麴草样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的含有量均有较大差异。西藏地区的18批样品检查项指标比较稳定，水分均 ＜ 10.0%，总灰分均 ＜ 10.5%，酸不溶性灰分均 ＜ 4.5%，浸出物均 ＞ 22.0%；而其他地区5批样品的检查项指标则差异明显。值得注意的是，绝大多数鼠麴草样品的总灰分含有量均较大，平均值高达9.02%，推测这可能是由于原植物地上部分密被绒毛，花序蓬松，容易藏纳风沙中的沙土所致。其中，SQC-19、SQC-20和SQC-22中不仅总灰分含有量极高，其酸不溶性灰分（去掉植物生理性灰分的部分）也异常高，从侧面证实了上述推测。

浸出物是反应药材质量的重要指标［23］，而现行藏区标准中尚未规定鼠麴草浸出物的限度。因此本研究以浸出物的出膏率和总黄酮含有量作为指标，分别考察了冷浸法、热浸法以及7种提取溶剂（无水乙醇、80%乙醇、60%乙醇、稀乙醇、40%乙醇、20%乙醇和纯水）对鼠麴草浸出物的影响，结果发现以稀乙醇作提取溶剂采用热浸法提取时，浸出物含有量和总黄酮含量均高于其他组。

3.3 含量测定

黄酮类成分为鼠麴草的主要活性成分［9-11］，现行各地方标准中均未有含量测定项［1，16-19］。因此，本研究建立了同时测定鼠麴草中木犀草素和芹菜素的HPLC含量测定方法，该方法简单、稳定，可作为评价鼠麴草质量的重要手段。经过对色谱条件的优化，将有效检测时间控制在45 min以内的等度洗脱（其他时间为冲柱和平衡）；同时，对包括提取溶剂（无水乙醇、甲醇、80%甲醇和60%甲醇）、提取方式（回流和超声）、提取时间（15、30和60 min）及料液比（1： 30、1 ： 50和1 ： 100）等因素在内的供试品溶液的制备进行优化。最终确定了“1.5.3”项下供试品溶液制备方法。此外，鼠麴草样品富含绒毛，粉碎后绒毛成棉絮状，与其他粉末分离，不易混匀，取样量过少时难以均匀取样。在进行加样回收率试验时，称样量减半后为0.25 g，测定结果不稳定，加样回收率偏差较大；若将称样量设为1.0 g时，供试品溶液中的其他干扰峰数量及峰高会增多（图2B），增加了洗脱难度且易使硅胶柱过载，降低分离效果，因此在建立含量测定方法时将称样量定为0.5 g。而在加样回收率试验时为了减小取样造成的不均因素，将称样量也设为0.5 g，按含有量 ： 加入量（2： 1）添加对照品。

3.4 质量评价

本研究采用聚类分析和主成分分析法对不同产地鼠麴草药材的质量进行评价。结果表明，西藏地区鼠麴草样品分布集中、质量均一、样品间差异较小，而市场购买及川西地区的鼠麴草样品（SQC-19、SQC-20、SQC-22和SQC-23）间的质量差异性较大，综合得分排名靠后，质量较差。虽然西藏地区和其他地区的鼠麴草样品基源相同，但其质量却有较大差异。此外，在国内其他地区（尤其是低海拔地区）的标准中，以“鼠曲草”之名收录的药材，虽然其基源与西藏地区相同，但由于受到海拔、气候和环境等因素的影响，在植物形态（植株大小、直立或匍匐等）和化学成分含量上均存在一定差异。因此，在制定西藏自治区地方标准时建议对样品的采集范围或者产地进行限定，以保证药材的质量。

值得注意的是，川西地区的2批（SQC-22和SQC-23）样品在地理和气候上与西藏地区相近，但药材质量却也表现出明显差异，限于样本量较少，仅2批药材难以判断出是个体差异还是共性问题，在后续的研究中也将继续补充该地区的样品做进一步研究。由于藏医和中医指导理论的不同，西藏地区收载的“鼠麴草”与其他地区收载的“鼠曲草”在功效与主治上也有诸多差异。在后续的研究中，可结合药效学分别对藏医和中医体系下的该药物进行深入的对比研究。

4 结论

本研究对鼠麴草的TLC定性鉴别、检查项及HPLC含量测定进行较为系统及全面的研究，为该药材的质量控制提供了有效的科学手段，同时也为相关地方标准的完善提供了参考依据。