环氧化酶－２基因和蛋白在人肾癌组织中的表达

夏艳飞　阳冬芳　李海军　曾令斌

【摘要】 目的 探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因和蛋白在肾癌组织中的表达及与其分型之间的关系。方法 收集经手术病理证实肾癌组织的标本39例和正常肾组织8例,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及Western免疫印迹分别检测COX-2 mRNA及蛋白的表达水平。结果 肾癌组织中的COX-2的基因和蛋白的表达明显高于正常肾组织组(P<0.01)；在三种类型的肾癌中，混合型肾癌组织中COX-2表达最强，颗粒细胞癌的表达水平次之，肾透明细胞癌中表达最少(P<0.01)。结论 COX-2的基因和蛋白的表达在肾癌组织中增高且与其病理分型密切相关。

【关键词】 肾癌；环氧化酶-2；基因；蛋白质

环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是前列腺素合成过程中的重要限速酶,它在某些肿瘤组织中高表达,可能参与肿瘤的发生与发展。肾癌是一种常见的泌尿系统肿瘤,发生率仅次于膀胱癌。本研究采用Western免疫印迹及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测人不同临床类型的肾癌组织中COX-2基因和蛋白质的表达，初步探讨COX-2的表达与肾癌病理分型之间的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2004-2007年本院术后经HE 染色病理证实肾透明细胞癌39例,其中男28例,女11例,年龄35~66岁(平均48.5岁),其中透明细胞癌19例,颗粒细胞癌12例,混合型8 例。切取距离肿瘤3 cm以外的正常肾脏组织8例为对照,经病理检查无癌细胞浸润。

1.2 主要试剂 Reverse Transcription System购自美国Promega公司；COX-2及GAPDH上、下游引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其他试剂均为国产试剂。

1.3 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肾癌组织COX-2 mRNA的表达 用TRIzol 试剂提取细胞总RNA，溶于无Rnase水中，紫外分光光度计测定OD260/OD280 的比值在118~210。取总RNA 2 μg，用Promega公司逆转录试剂盒合成cDNA，再取逆转录产物110 μl进行PCR循环。内参照采用GAPGH，引物序列为:上游5′-AACTTTGGCATT GTG2GAAGG-3′，下游5′-TGTGAGGGA GATGCTCAGTG-3′，扩增片段长度为599 bp。COX-2引物序列：上游5′-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT TGCT-3′,下游5′-AGATCATCTCTGGCCTGAGTATCTTT-3′,扩增片断长度305 bp。PCR反应条件：95℃温育3 min，94℃变性45 s，60℃复性40 s，72℃延伸30 s，30个循环，末次循环72℃延伸10 min。反应结束后，取RT-PCR 产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，加样量均为5 μl，溴化乙锭染色。电泳条带采用UVP型凝胶图像分析系统做积分吸光度测定和分析，以各组目的基因与内参照基因的RT-PCR扩增DNA片段的吸光度值减去背景值的比值来比较待测基因的mRNA表达差异。

1.4 Western免疫印迹检测COX-2蛋白质的表达 取肾癌组织及对照正常肾组织，用PBS洗涤3次，洗去残血，加入三去污剂裂解缓冲液裂解组织提取蛋白，BCA法蛋白质定量。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离（积层胶80 V，分离胶120 V）后，半干转移法进行电转移（60 mA 1 h）至PDVF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，按1∶1000比例加入兔抗人COX-1一抗，于室温孵育1 h；TBST洗涤3次，每次5 min；按1∶1000比例加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min；然后用Western blot荧光检测试剂激发荧光，显示于X光片。结果用凝胶图像分析系统对胶片扫描进行分析。

1.5 统计学方法 实验所得数据采用均数±标准差（x±s）表示，数据统计采用t检验。

2 结果

2.1 肾癌组织及正常肾组织中COX-2 mRNA的表达 RT-PCR分别检测肾癌组织及正常肾组织COX-2 mRNA的表达水平，结果发现，在正常肾组织中，COX-2的基因表达很少，大部分呈阴性表达。而肾癌组织中其表达明显增加，且三种类型的肾癌中，混合型肾癌组织中表达最强，肾透明细胞癌中表达最少，而颗粒细胞癌的表达水平居中（结果如图1）。

2.2 肾癌组织及正常肾组织中COX-2蛋白的表达 Western免疫印迹法分别检测肾癌组织及正常肾组织COX-2 蛋白质的表达水平，结果发现，在正常肾组织中，COX-2蛋白表达较少，而肾癌组织中其表达明显增加，其中混合型肾癌织中表达最强，颗粒细胞癌的表达水平次之，肾透明细胞癌中表达最少（结果如图2）。

3 讨论

肾癌是肾脏最常见的恶性肿瘤,发病率约占肾恶性肿瘤的80%,占全身恶性肿瘤的3%。其生物学行为多变，发病机制以及发生、发展的分子生物学基础及预后仍不清楚。近年来，有研究发现犬科动物肾细胞癌模型体内COX-2具有高表达，并在肿瘤细胞增长调节方面起重要作用，COX-2与肾盂移行细胞癌的分型和分期的具有相关性，而COX-2选择性抑制剂可用于防治肾细胞癌［1-3］。

环氧化酶是花生四烯酸合成前列腺素(prostaglandin,PG)的一个限速酶，可将花生四烯酸转变为各种PG产物，维持机体的各种病理生理过程。目前发现哺乳动物COX 至少有2种同工酶，即COX-1和COX-2，其中COX-2为诱导性表达，静息时并不表达，在大多数正常组织难以发现，一般只在受刺激时迅速合成，这种刺激因子可为细胞因子、生长因子、促癌剂以及癌基因产物等。COX-2在致癌作用中充当重要角色，研究发现它在人体结肠癌、直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、喉癌等组织中检测到COX-2的高表达［4］。罗洪波等通过免疫组化研究认为，肾细胞癌中COX-2的高表达与肾癌的分级、分期、分型及肿瘤侵袭转移有关［5］,也有研究提示COX-2与肾细胞癌病理分级成正相关［6,7］,吕红凯等［8］在研究中认为，COX-2对肾癌的早期诊断有意义，这些数据说明COX-2 与肾细胞癌发生发展之间联系密切。

本研究通过收集临床病例并进行分型，检测了不同临床类型的肾癌组织中COX-2 mRNA和蛋白质的表达，结果发现，在正常肾组织中，COX-2基因和蛋白的表达较少，大部分呈阴性，而肾癌组织中其表达明显增加。在三种不同临床类型的肾癌组织中，混合型肾癌组织中表达最强，颗粒细胞癌的表达水平次之，肾透明细胞癌中表达最少。结果提示，COX-2的表达与肾癌的分型有关，其中与混合型肾癌的关系最为密切，检测COX-2的表达有利于协助肾癌的分型诊断。COX-2的表达为肾癌发生的早期事件，与肾癌的发生、发展有关，有可能作为肾癌早期诊断及分型的指标，并有可能为肾癌的预防提供新的靶向。

参 考 文 献

［1］ Khan KN,Stanfield KM,Trajkovic D,et al.Expression of cyclooxygenase-2 in canine renal cell carcinoma.Vet Pathol,2001,38 (1):116-119.

［2］ Oku S,Higashi M,Imazono Y,et al.Overexpression of cyclooxygenase-2 in high-grade human transitional cell carcinoma of the upper urinary tract.BJU Int,2003,91 (1):109-114.

［3］ Hara S,Kondo Y,Matsuzawa I,et al.Expression of cycloxygenase-2 in human bladder and renal cell carcinoma.Adv Exp Med Biol,2002,507:123-126.

［4］ 敬前程，罗志强.环氧化酶2在鼻咽癌的研究进展.医学综述，2008,14(20):3078-3081.

［5］ 罗洪波，刘修恒，陈智敏，等.肾细胞癌COX-2 及MMP-2 的免疫组化研究.肿瘤防治研究,2005,32 (6 ):354-356.

［6］ Hashimoto Y,Kondo Y,Kimura G,et al.Cyclooxygenase-2 expression and relationship to tumour progression in human renal cell carcinoma.Histopathology,2004,44:353-359.

［7］ 王沈阳，李相洲，卢洪凯，等.环氧化酶-2在人肾透明细胞癌中的表达及意义.潍坊医学院学报,2007,29(2):123-125.

［8］ 吕红凯，张雁钢，王东文.COX-2 在肾癌中的表达及其临床意义.临床医药实践杂志，2008,17(1):13-16.