花生内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析

杨 森

摘要设计1对特异引物,以花生栽培种四粒红及其与野生种光叶花生的种间杂种为材料,对花生ITS1-5.8S-ITS2序列进行高保真PCR扩增,获得长度约800bp的单一条带,在对PCR产物进行克隆测序的基础上构建了花生属进化树。

关键词花生;内转录间隔区(ITS)序列;PCR;进化树

中图分类号Q789文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)08-0103-02

内转录间隔区序列(ITS)广泛应用于被子植物系统进化研究,为禾本科、大豆属、棉属等植物的系统进化研究提供了宝贵的分子遗传学依据。花生rDNA有关研究报道较少,尽管有分离 rDNA ITS的报道,但未在此基础上进行花生属植物的系统发育分析。本研究对花生ITS序列进行分离、测序,并将其与GenBank中登录的花生ITS序列进行比较和分析,为花生的系统演化及花生的分类鉴定提供分子水平的证据。

1材料与方法

1.1材料

试验所用花生为栽培种四粒红(Silihong)及四粒红与野生种光叶花生的杂交后代(Silihong×Arachis glabrata Benth.)高世代材料。花生种子取自山东省花生研究所莱西试验站。

根据Bhagwat等报道的ITS序列,使用软件DNAS-TAR.Lasergene.v7.1设计1对特异引物:

ITS1&2-1∶5-GTCGATGCCGCACAAACCAGGATT-3

ITS1&2-2∶5-CGGGCACAACGGGGCTCTCA-3

这对引物的扩增区包含ITS1、5.8S和ITS2完整区域。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2方法

取3~5粒花生未成熟的叶片置于1.5mL离心管中,加40μL 0.25mol/L NaOH,用1mL枪头套一PCR管将叶片捣碎,煮沸30s,加160μL含PVP-40的Tris-HCl(pH值7.6),煮沸2min,10 000rpm离心5min,取上清液4℃保存,用时取1μL作模板。取1-1D4-1、1-4D4-1、四粒红各品种未成熟叶片按上述步骤作简单处理,依次编号为1、2、3作为PCR模板。

PCR程序为:94℃ 5min,(94℃ 1min,52.1℃ 1min,72℃ 1.5min)30个循环,72℃ 10min。先用Takara Taq DNA聚合酶作PCR,确定有预期分子量大小的条带后再用高保真Pfu DNA聚合酶扩增,切胶回收DNA,连接转化后挑取阳性克隆测序。……