莲心碱对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织中一氧化氮和一氧化氮合酶的影响

余万桂，邓德明，张恒文 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

杨 涛 (荆州市中医医院内科，湖北 荆州 434023)

张道明，刘 莲 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

莲心碱对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织中一氧化氮和一氧化氮合酶的影响

余万桂，邓德明，张恒文 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

杨 涛 (荆州市中医医院内科，湖北 荆州 434023)

张道明，刘 莲 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

目的：观察莲心碱对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后脑组织一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响，为莲心碱治疗脑缺血提供实验依据。方法：线栓法阻塞大鼠大脑中动脉2h/再灌注24h制备大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型。24只SD雄性大鼠随机分为3组：假手术组、缺血再灌注组和莲心碱(3mg/kg)组，分别于术前30min、再灌注即刻、再灌注12h舌静脉注射莲心碱3mg/kg。再灌注24h后处死大鼠，取脑组织以硝酸还原酶法测定脑组织中的NO水平，以化学比色法测定总NOS活性，并测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力。结果：大鼠脑缺血2h、再灌注24h后，脑组织NO水平显著升高，总NOS和iNOS 活性显著增加，莲心碱可显著降低缺血再灌注损伤大鼠脑组织NO含量和总NOS、iNOS 活力。结论：莲心碱可能通过降低NO对脑缺血再灌注损伤后的神经毒性作用而发挥脑缺血的保护作用。

莲心碱；脑缺血/再灌注损伤；一氧化氮；一氧化氮合酶

一氧化氮(NO)以L-精氨酸为底物，在一氧化氮合酶(NOS)催化作用下生成，是一种重要的信使分子，参与多种疾病的病理生理过程，在脑缺血再灌注损伤中起重要作用[1]。莲心碱是从中药莲子芯中提取分离得到的双苄基异喹啉类化合物，具有降压、抗心律失常等心血管活性[2]，文献报道与莲心碱同属莲子心主成分的另一生物碱——异莲心碱对实验性脑缺血损伤和脑缺血/再灌注损伤均具有保护作用，其保护作用可能与它抗氧化和抗自由基损伤有关[3]。同时我们在实验中观察到莲心碱对脑缺血有保护作用[4]。本实验观察莲心碱对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后脑组织NO水平和NOS活性的影响，为莲心碱治疗脑缺血提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药物 莲心碱由武汉大学药学院药物化学研究室提供(含量为96.8%)，为微黄色结晶，实验时，加1mol/L盐酸溶解，再以0.1mol/L 氢氧化钠将pH调至5.8，置冰箱内保存备用。

1.1.2动物 大鼠，SD种，一级，雄性，体质量200～240g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(动物中心许可证号为SYXK(鄂)2004-0028，动物合格证号为SCXK(鄂)2004-0007)。

1.1.3试剂与仪器 NO和NOS 测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所； 756mc紫外分光光度计。

1.2方法

1.2.1动物模型制备与分组 健康雄性SD大鼠24只，随机平均分为3组，即假手术组、缺血再灌注组和莲心碱组。3组大鼠分别予以戊巴比妥钠30mg/kg，腹腔注射麻醉，线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)/再灌注模型[5]。缺血2h后轻轻提拉所留线头至有阻力时再灌注24h，分别于术前30min、再灌注即刻、再灌注12h舌静脉注射莲心碱3mg/kg，缺血再灌注组舌静脉注射同等剂量生理盐水，假手术组不给于处理。

1.2.2脑缺血体积的测量 大鼠断头取脑，去除嗅球、小脑及低位脑干后，脑组织放于-20℃冰箱中，冷冻20min，取出后间隔3mm连续做冠状切片，置于1%TTC磷酸缓冲液中，37℃下恒温避光孵育30min，正常组织染成红色，梗塞灶染成白色，脑片置4%多聚甲醛固定，数码相机拍照，多媒体彩色病理图像分析系统进行处理,计算出大鼠的梗死灶体积和体积百分比。

1.2.3脑组织匀浆制备 大鼠再灌注24h，断头处死，立即于冰浴上取出损伤侧的大脑皮层，称取0.5g前脑组织，置于4.5ml 4℃匀浆介质中充分研磨使组织匀浆化，4℃ 3 000r离心10min，上清液即为脑组织匀浆，留取1ml置-20℃贮存待测。

1.2.4脑组织NO含量和总NOS、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力测定 严格按试剂盒说明，以硝酸还原酶法测定脑组织匀浆中NO含量，NO活性单位以μmol/g表示。以化学比色法测定总NOS活性，并根据对钙的依赖性测定iNOS并测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力。

2 结 果

2.1脑缺血体积变化经TTC染色后，缺血再灌注组大鼠脑梗死体积百分比为(28.91%±3.71%)，与假手术组比较明显增多(Plt;0.01)；莲心碱组脑梗死体积百分比为(10.33%±2.87%)，与缺血组比较明显减少(Plt;0.01)。

2.2各组大鼠NO、NOS和iNOS的比较与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠脑组织中NO、NOS和iNOS水平明显升高；与缺血再灌注组比较，莲心碱组大鼠脑组织NO、NOS和iNOS水平明显降低。结果见表1。

表1 各组大鼠脑组织NO、NOS和iNOS的检测结果

注：与假手术组比较，**Plt;0.01；与缺血再灌注组比较，△Plt;0.05。

图1 对照组Hsp-70阳性细胞数(×40) 图2 预处理组Hsp-70阳性细胞数(×40)

图3 对照组TUNEL阳性细胞数(×40) 图4 预处理组TUNEL阳性细胞数(×40)

3 讨 论

莲心碱是从中药莲子芯中提取分离得到的双苄基异喹啉类化合物，具有降压、抗心律失常等心血管活性[2]。莲子心中含有主要生物碱有莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱等。文献报道与莲心碱同属莲子心主成分的另一生物碱——甲基莲心碱，具有减轻光化学诱导大鼠脑缺血的作用，其机制可能与对抗脑缺血时NO、Ca2+的病理性改变有关[9]，另有文献报道异莲心碱对实验性脑缺血损伤具有保护作用与其抗脂质过氧化，氧自由基生成和增强氧自由基的清除有关[3]。前期研究表明莲心碱可减轻脑缺血/再灌注所造成的损伤，改善脑功能[10]。

本实验结果提示，莲心碱可能通过降低NO的神经毒性而对缺血再灌注脑损伤发挥保护作用，但缺血再灌注脑损伤的发生机制复杂，各种因素间可能相互促进、相互影响，莲心碱究竟是通过直接还是间接途径降低NO的神经毒性，值得进一步探讨。

[1]张建新，张会欣，李兰芳，等.大鼠局灶性脑缺血后一氧化氮合酶基因表达的变化[J].中国应用生理学杂志，2005，21(3)：246-247.

[2]许磊，姚崇舜，陈济明.莲心碱的研究概况[J].中草药，2000，31(12)：955-957.

[3]徐俊英，彭佳林，王嘉陵.异莲心碱对实验性脑缺血损伤的保护作用[J].中国医院药学杂志，2005，25(11)：1026-1028.

[4]余万桂，张道明，邓德明，等. 莲心碱对大鼠局灶性脑缺血的保护作用[J].长江大学学报(自然版)医学卷，2006，3(3)：213-214.

[5]Longa EZ，Weistein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[6]Samdani AF, Dawson TM, Dawson VL. Nitric oxide synthase in models of focal ischemia[J]. Stroke,1997，29:1283-1288.

[7]Plotkine M, Margaill I. NO synthases: new pharmacological targets incerebrovascular accident[J]. Therapie, 2002，57(6): 548-553.

[8]Holtz ML, Craddock SD, Pettigrew LC. Rapid expression of neuronal and inducible nitric oxide synthases during post-ischemic reperfusion in rat brain[J]. Brain Res, 2001，898(1): 49-60.

[9]刘剑萍，唐伟军，吴俊，等.甲基莲心碱对光化学诱导大鼠脑缺血损害的保护作用[J].中国临床药学杂志，2002，11(5)：267-269.

[10]余万桂，张恒文，邓德明，等.莲心碱对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用[J].中药药理与临床，2007，23(3)：23-25.

[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.002

R364.12

A

1673-1409(2009)04-R003-03

2009-09-17

湖北省卫生厅科研基金资助项目(JXzb74)；长江大学校基金项目(05Z1809)

余万桂(1970-)，女，湖北荆州人，副教授，硕士生导师，从事生理学教学与研究工作。